酶比色法和雷氏盐分光光度法在测定婴幼儿乳粉中胆碱的比较

刘旻雯

摘 要：关于婴儿食品和乳品中胆碱测量的最新国家标准相比较之前的在测量方法上增加了第二法雷氏盐分光光度法，为了研究第一法酶比色法与第二法雷氏盐分光光度法，对这两个方法进行对比。结果发现两种方法的试验结果相近，酶比色法适合大批样品，操作更简单，但成本较高;雷氏盐分光光度法的试验条件以及成本条件更适合大多数生产企业。

关键词：胆碱;酶比色法;雷氏盐分光光度法

Abstract：According to the latest about the measurement of the choline in baby food and milk products national standard compared to before on the measuring method of increased light redwood salt spectrophotometry， the second method to study the method of enzyme colorimetry and the second Rays salt spectrophotometry， light to comparison of these two methods， found that the test results of two methods， enzymatic colorimetric method is suitable for a large number of samples， operating more simple， but the cost is higher; The test conditions and cost conditions of Rays salt spectrophotometry are more suitable for most production enterprises.

Key words：Choline; Enzyme colorimetry; Rays salt spectrophotometry

中圖分类号：TS207.3

胆碱是人们日常生活中必须摄入的有机碱性物质，可为机体提供可变甲基，从而作用于合成甲基的产物，不但存在于卵磷脂中，也大量存在于神经鞘磷脂中。在平时饮食中，摄入合适的胆碱有益身体健康：①降低血清胆固醇含量。②加速体内甲基代谢。③加速脂肪代谢。④控制细胞的死亡。⑤保证信息传递。⑥保证脑细胞的合理的分裂、分化，同时增强记忆力。

胎儿大脑的海马体在孕妇怀孕25周以后开始发育，持续到小孩4周岁。胎儿的营养摄入取决于孕妇的饮食习惯，为了使胎儿的大脑正常发育，在孕妇还未分娩之前，即在胎儿大脑正处于海马体发育阶段，孕妇应根据相关的要求饮食过程中需要摄入含有一定量胆碱的物质，如果在这阶段孕妇摄入的胆碱量不够或者没有增加含有胆碱的物质，则会严重影响胎儿的脑部发育，会使胎儿脑部细胞无法正常分裂和分化，最终会导致生下的幼儿存在一定的大脑缺陷，但胆碱的摄入量也不易过多[1-2]。通过查询《中国居民膳食营养素参考摄入量》指导书，可知我国孕妇在其分娩前应保证每天需要摄入500 mg的胆碱。为了确保孕妇胆碱量的摄入量，我国也推出一款专门为孕妇饮用的奶粉。

从生物化学角度分析，胆碱属于碱性很强且带有正电荷的物质，其化合价为四价，是所有生物膜的组成成分和胆碱能神经元中乙酰胆碱的前体。胆碱性质的稳定性与所处的环境有关，它在空气中遇热容易分解，容易吸收CO2，但是它在酸性溶液中对热稳定，吸水能力超强。胆碱味辛而苦，在日常生活中的形态多为黏性液体或者结晶固体，能够和水、醇类化学物质相溶。

本文通过检测原理、试剂与仪器、检测步骤、结果比较等几个方面，以奶粉中胆碱的测定为例，对酶比色法和雷氏盐分光光度法进行比较，以便食品检测人员更好的开展奶粉中胆碱的检测工作。

1 检测原理

1.1 酶比色法

根据胆碱在酸性溶液中对热稳定的性质，首先将其溶解在酸性溶液中，然后变成游离态的胆碱，然后在溶液中加入酶氧化剂，使其氧化的产物与发色剂发生反应，生成有色物质，在合理的胆碱浓度范围内，生成物颜色的深浅与胆碱含量成正比的线性关系[3]。

1.2 雷氏盐分光光度法

利用氢氧化钡与甲醇以及三氯甲烷的混合液对需要测定的样品进行水解，然后利用弗罗里硅士层析净化，然后与雷纳克铵盐溶液发生反应，形成带颜色的胆碱雷纳克铵盐，再利用丙酮溶液洗出其他的物质，最后用波长为526 nm的波来测定物质的吸收值，在合理的胆碱浓度范围内，生成物颜色的深浅与胆碱含量成正比的线性关系。

2 试剂与仪器

2.1 酶比色法

三羟甲基氨基甲烷、苯酚、浓盐酸、氢氧化钠、胆碱氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、磷脂酶D、pH计、分光光度计[3]。

2.2 雷氏盐分光光度法

氢氧化钡、甲醇、三氯甲烷、弗罗里硅土、丙酮、雷纳克铵盐、冰乙酸、乙酸甲酯、分光光度计。

3 操作步骤

3.1 酶比色法

取5 g实验样品奶粉，将其轻轻倒入100 mL锥形瓶中，并且注入30 mL的盐酸溶液，盖上锥形瓶的盖子，将锥形瓶放在70 ℃热水中水解3 h，期间每隔30 min摇晃一次，最后冷却。用氢氧化钠溶液将锥形瓶中溶液的pH值调到3.5～4.0，然后将锥形瓶内混合液倒入容量为50 mL的容量瓶中，并加入蒸馏水定容，用滤纸过滤水解液至100 mL烧杯中。取4个容量为10 mL的容量瓶，分别加入2、4、6、8 mL的胆碱氢氧化物标准溶液，然后分别加入蒸馏水，稀释至

10 mL，浓度分别为50、100、150、200 μg/100 mL。再取出6支试管，其中一个试管用来存放空白试剂（A），剩下5支试管，编上好试管的顺序（1、2、3、4、5），分别用来存放标准溶液以及稀释的溶液，按表1加入试剂。将每个试样准备2支试管（B、C），试管B加0.1 mL待分析滤液和3 mL蒸馏水，试管C加0.1 mL待分析滤液和3 mL发色剂。使用密封膜封住试管（1、2、3、4、5、A、B、C），把试管中的混合物摇匀，然后置试管于37 ℃的水中反应15 min，然后冷却到室温。为了忽略蒸馏水吸光值的影响，在波长505 nm处单独测量蒸馏水吸光值。测定不同浓度标准溶液在

505 nm波长处的吸光值，以6支试管的胆碱溶液浓度为横坐标、纵吸光值减去蒸馏水吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

3.2 雷氏盐分光光度法

量取重量为10 g的试样装入到锥形瓶中，然后量取50 mL的氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷提取液倒入锥形瓶中和试样溶液进行混合，待其混合均匀后，通过相应胶管和回流装置进行连接，连接完成后，将整体放入到（79±2）℃的水浴锅内，水解抽提4 h并且每隔1 h需要振荡一次，防止试样结成块状。结束后，随即取出锥形瓶并且使其冷卻到室内温度，进行过滤，不可通过过滤装置的物体使用冰乙酸甲醇混合液清洗三四次，洗涤后的溶液进行收集，并且装入到100 mL的容量瓶中，然后加入一定量的甲醇溶液定容，随即摇动直到溶液均匀混合为止。在滴头和层析柱之间使用专门的胶管连接，完成连接后，需要使用脱脂棉覆盖到层析柱底部，并且在脱脂棉表面倒入5 cm厚度的弗罗里硅土，使用甲醇润湿。依次把10 mL的试样水解液和标准的胆碱溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL浇在层析柱上，待溶液完全流到柱床上时，利用5 mL和10 mL甲醇、20 mL乙酸甲酯清洗层析柱。然后在这基础上加入5 mL的雷纳克铵盐溶液，再利用冰乙酸洗掉残余的雷纳克铵盐，直到层析柱展现硅土原有的白色，然后再用丙酮清洗胆碱雷纳克铵盐，洗后的溶液收集在10 mL的瓶子中，测定526 nm处的吸光值，绘制曲线。其中横坐标为胆碱酒石酸氢盐含量，纵坐标为标吸光值。

4 结果与分析

4.1 酶比色法

4.1.1 标准曲线

酶比色法标准曲线如图1所示。酶比色法的标准曲线为y=0.002 8x，R2=0.998 9，线性关系良好。

4.1.2 精密度试验

对试样奶粉重复6次测定，结果如表2。由表3实验结果计算可得，6次检测结果的平均值为158.64 mg/100 g，标准偏差为1.04，相对标准偏差（RSD）为0.66%。

4.2 雷氏盐分光光度法

4.2.1 标准曲线

雷氏盐分光光度法标准曲线如图2所示。雷氏盐分光光度法的标准曲线为y=0.037 4x，R2=0.999 2，线性关系良好。

4.2.2 精密度试验

对试样奶粉重复6次测定，结果如表3。由表3实验结果计算可得，6次检测结果的平均值为156.03 mg/100 g，标准偏差为2.06，相对标准偏差（RSD）为1.32%。

5 结论

相比之下，酶比色法和雷氏盐分光光度法对于试样奶粉的测试结果相近，标准曲线、精密度试验均能达到标准的要求。相较于雷氏盐分光光度法而言，酶比色法操作步骤相对更简单，水解后，只需要配制酶显色溶液即可上机测定，而雷氏盐分光光度法需要制备层析柱，水解后，试样溶液和标准溶液都要过柱之后才能上机测定;酶比色法水解时间相对要短，且水解时只需加盖至于水浴内，不需要连接回流装置，样品数量不受制于回流装置，更适合大量样品的处理。酶比色法有成批量、快捷、简单的优点。然而，酶比色法实验中需要用到3种酶，且都需要进口，对于生产企业而言，成本过高。而雷氏盐分光光度法所用试剂皆为常规试剂，也不需要特殊的仪器设备，操作步骤也算简便，一般实验室都具备试验条件，成本相对要低很多，更适合于大多数乳品生产企业。

参考文献：

[1]刘美霞，李 红，王 佳，等.乳粉中胆碱含量检测方法的研究[J].中外食品，2014（6）：38-43.

[2]赵红霞，郝万清.雷氏盐比色法检测婴幼儿配方乳粉中胆碱含量[J].乳业科学与技术，2012，35（2）：41-43.

[3]国家卫生和计划生育委员会.GB 5413.20-2013 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定[S].北京：中国标准出版社，2014.

[4]尹凤芝，张 慧.婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定——雷氏盐分光光度法[J].生命科学仪器，2013，11（1）：54-57.