回顾性分析环介导等温扩增技术LAMP在肺结核患者痰标本中的应用

卢元全

【摘  要】目的 ：探讨环介导等温扩增技术（LAMP）在肺结核患者痰标本中的应用效果。方法 ：选取2018年2月-2018年11月本院接收的50份肺结核且抗结核治疗涂片阳性患者痰标本、50份涂片阴性患者痰标本，每份痰标本同时利用LAMP法检查检核分枝杆菌复合群核酸、培养罗氏固体（L-J），分别对L-J培养及LAMP法阳性率计算。结果： 50份痰涂片抗酸染色阳性标本中，LAMP检测阳性50份，L-J培养阳性42份，检出率分别是100%和84.00%，差异显著（P<0.05）;50份痰涂片抗酸染色阴性标本中，LAMP法与L-J培养阳性分别有15例和8例，相比于痰涂片阴性标本，LAMP阳性率较L-J培养阳性检出率更高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论： 环介导等温扩增技术在肺结核痰标本诊断中应用效果显著，而且该方法具有操作简单、方便等特点。

【关键词】肺结核;环介导等温扩增技术（LAMP）;抗酸染色

【中图分类号】R446.5      【文献标识码】A       【文章编号】1672-3783（2019）12-0108-01

结核病是常见慢性传染病疾病之一，该病主要是因为结核分枝杆菌造成的，是三大传染疾病之一。据有关资料显示[1]，2015年全球大约有1049万新发结核疾病，其中140万左右死于结核病。早期研究显示，活动性结核病在结核病传播控制中具有重要作用。本次实验针对环介导等温扩增技术在肺结核患者痰标本中的应用效果进行分析，以下是具体报告。

1 研究资料与方法

1.1 研究资料

选取2018年2月-2018年11月本院接收的50份肺结核且抗结核治疗涂片阳性患者痰标本、50份涂片阴性患者痰标本，其中，60例男性，40例女性;年龄18岁-82岁，均值（46.51±3.46）岁。

1.2 方法

恒温荧光核酸扩增仪，型号LF-160;Loopam核酸快速提取试剂盒、Looamp结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒。

方法：

1.2.1 痰结核分枝杆菌镜检与涂片

通过直接图片抗酸染色显微镜检查，根据《中国结核病防治规划?痰涂片镜检标准化操作及质量保证》对痰标本收集，并涂片镜检，每例送合格痰标本1份。

1.2.2 L-J结核分枝杆菌培养

取4倍体积的4%NaOH溶于镜检，并通过LAMP法对其他合格痰标本检测，均匀摇晃、震荡，并放置15分钟，充分液化痰标本。利用一次性无菌吸管吸取2-3滴，并在2管酸性培养基斜面上、中、下位置滴注，盖紧盖子，后将标本置于37℃培养箱中培养，接种4周后，平均7日进行1次观察。

1.2.3 LAMP法检测结核分枝杆菌复合群

①样本前处理：1）在样本处理会馆中分别放置40-60μL痰液及阴性对照;2）翻转3-5次样本处理试管，并将其置于恒温荧光核酸扩增仪中加热，加热至90℃，时间为5分钟;3）完成加热后，将样本处理试管取出，放置室温中保存，时间为2分钟，颠倒混合3-5次;4）将吸附试剂管盖子取出，然后将样本处理试管拧入;5）垂直用力震荡吸附管10次，水平用力甩动10次。均匀混合，液体以浅黄色或者乳白色呈现出来;6）在注射帽上面环套吸附管，倒置吸附管，在吸附管中推注注射帽，旋紧固定;②样本及试剂溶液混合：1）在加热管架上方放置注射帽顶端帽环，使拍管架与眼睛呈水平方向，在反应管内垂直放入纯化装置尖端，开始加样;2）对纯化装置吸附管持续挤压，滴加反应液到两刻度见，将反应盖盖子盖紧，并标记;3）在所有样本中均匀加入反应管后，将阳性对照管打开，取出1根毛细管，上端捏紧后，见阳性对照插入其中，吸取液体缓慢放松，一直到刻度线，然后将其拧入到LAMP反应管中，后将毛细血管丢弃，然后将反应管该盖子、阳性对照管盖好;4）紧握反应管底端，盖子上甩入全部反应液，倒置2分钟，充分混合反应液与干燥的LAMP试剂;③LAMP扩增反应：1）在反应液与待试剂均匀混合后，上下翻转反应管5次，用力甩反应液至反应管底部，然后在恒温荧光核算扩增仪前端反应模块中放置反应管，将盖子盖好;2）在反应模块温度高达67℃后，打开右侧计时开关，然后开始进行LAMP反应，时间设置为40分钟;④检测荧光目视：结束LAMP扩增反应后，将反应管取出，并置于恒温荧光核酸扩增仪荧光检测模块，将荧光开关打开观察。

1.3 观察指标

分析痰液阳性标本中L-J培养分枝杆菌与LAMP法检出结果、痰液标本中L-J培养与LAMP法阳性检出率。

1.4 统计学方法

采取统计学软件SPSS19.0对本次实验数据准确分析，计数资料的表示方法与检验值分别是率（%）和x2，两组对比，差异显著（P<0.05）。

2 结果

2.1 对比痰液阳性标本中L-J培养分枝杆菌与LAMP法检出结果

50份痰涂片抗酸染色阳性标本中，LAMP检测阳性50份，L-J培养阳性42份，检出率分别是100%和84.00%，差异显著（P<0.05），如下表1：

2.2 对比痰涂阴标本中L-J培养与LAMP法阳性检出率

在痰涂片阴性标本中，LAMP阳性率较L-J培养阳性检出率更高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2：

3 讨论

有效、快速诊断结核疾病在结核疾病控制总具有重要作用。现阶段，主要通过涂片抗酸染色、结核杆菌培养方式诊断结核病，但是，结核杆菌涂片抗酸染色具有较低的检出率，一般是30-40%[2]。结核杆菌培养时间长，往往需要13-29天，无法达到及早诊断的目的。LAMP是一种分子诊断技术，其具有检查快等特点，且价格适中3]。根据本次实验分析，LAMP阳性检出率较L-J培养阳性更优差异有统计学意义（P<0.05）。可见，LAMP检查法具有较高的应用价值。

总而言之，痰液标本阳性检出率方面，LAMP法较L-J更高，而且LAMP具有操作简单、方便、快捷等特点，而且灵敏度和特异度较高，值得采纳、推广。

参考文献

[1] 杨健， 张天华， 鲜小萍，等. 环介导等温扩增技术在肺结核病诊断中的应用评价[J]. 中国实验诊断学， 2018， 22（12）：57-60.

[2] 黄文焰， 刘开钳， 陳伊，等. LAMP技术在基层结核病诊疗机构推广应用研究[J]. 中国热带医学， 2017， 17（12）：1264-1266.

[3] 刘亚东， 冷雪， 时坤，等. 环介导等温扩增技术检测方法的研究进展[J]. 中国人兽共患病学报， 2018， 34（5）：460-465.