菌株Enterobacter sp.降解除草剂阿特拉津产物测定及降解基因克隆

刘丹丹，孙宛玉，刘 畅，马浩珂，王瑞娇，隋宇凡

(沈阳化工大学 环境与安全工程学院，辽宁 沈阳 110142)

在农业生产领域，三嗪类除草剂阿特拉津以显著的效果和低廉的价格，成为世界上应用最广的除草剂之一[1]。其常用于玉米、高粱、甘蔗等阔叶杂草和1年生禾本科杂草的防治[2-3]，但长期、大面积施用会对生态系统造成破坏。研究表明，阿特拉津是潜在的内分泌干扰物，会增加乳腺癌和纤维瘤发病率，造成两栖动物及哺乳动物的出生缺陷、生长影响、免疫系统损伤、中枢神经和心血管功能受损等[4-5]。因此，对于包括中国在内，仍在大面积使用阿特拉津的国家而言，解决其污染问题刻不容缓。

目前降解阿特拉津有水解、光解及生物降解等方式。自Wackeet 实验室分离出能够完全降解阿特拉津的菌株Pseudomonassp.至今[6]，大量功能性的微生物逐渐被人们所认识。综合近年来研究发现，农药的生物降解凭借高效、无二次污染、经济、操作简单等优势被广泛应用[7]。例如Alcaligenes、Pseudaminobacter、Ralstonia、Nocardioides、Arthrobacter等细菌被报道有降解阿特拉津的能力，并携带atzABCDEF或trzDFN降解基因，这2种降解基因有助于阿特拉津的矿化[8]。

试验表明，菌株Enterobactersp.对阿特拉津的降解能力超过90%[9]。鉴于此，本研究在前期工作基础上，以菌株Enterobactersp.为研究对象，利用液相色谱与质谱联用技术检测阿特拉津降解过程产生的关键代谢产物，并通过PCR扩增技术及GO功能富集分析对降解基因进行筛选和克隆,进一步探究阿特拉津降解途径。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

以前期试验分离获得的阿特拉津降解菌株Enterobactersp.为研究对象，其存放于沈阳化工大学环境科学实验室。

1.2 试剂

无机盐培养基：磷酸氢二钾1.6 g、磷酸二氢钾0.4 g、七水硫酸镁0.4 g、氯化钠0.1 g、葡萄糖3 g、阿特拉津0.1 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，pH值调至中性，121 ℃高压灭菌30 min[10]。以上所用试剂均为分析纯。阿特拉津(纯度约99.9%)、羟基阿特拉津(纯度>99%)、氰尿酸(纯度>99%)，均购自上海西格玛公司。尿素(纯度>99%)购自天津市大茂化学试剂厂。

1.3 阿特拉津降解率的测定

样品预处理：将菌株Enterobactersp.在含有100 mg/L阿特拉津的无机盐培养基中培养120 h。用等体积CHCl3和适量的NaCl溶液萃取[10]，取下层有机相，用旋转蒸发器于45 ℃浓缩，用甲醇定容到1 mL。

采用液相色谱法测定阿特拉津的残留量。检测条件为C18反相硅胶色谱柱(柱长250 mm×内径4.6 mm)，甲醇与水(V/V=80/20)为流动相，流速为1 mL/min，柱温25 ℃，进样量5 μL，检测波长213 nm[10]。阿特拉津降解率的计算参考YANG等[11]的公式:

式中，X为阿特拉津降解率，CX为阿特拉津的最终含量(mg/L)，CCK为阿特拉津的原始含量(mg/L)。

1.4 阿特拉津降解产物测定

采用液相色谱与质谱联用技术测定阿特拉津降解产物。进样前处理方法参照1.3中描述，降解产物经旋转蒸发器浓缩后，加入500 μL甲醇溶解，涡旋混匀后14 000 r/min离心10 min，取上清100 μL进样[12-14]。流动相梯度如表1所示。

表1 流动相梯度Tab.1 Mobile phase gradient

1.4.1 羟基阿特拉津 液相色谱：色谱柱Thermo Accucore C18(柱长100 mm×内径2.1 mm，粒径2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃。

质谱：电喷雾-正离子模式(SRM)，参数：毛细管温度300 ℃，气化器温度400 ℃，鞘气压力10 kPa，辅助气压力2 kPa，喷雾电压3 000 V(+)/4 000 V(-)。

1.4.2 氰尿酸 液相色谱：色谱柱Thermo Accucore C18(柱长100 mm×内径2.1 mm，粒径2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃。

质谱：电喷雾电离-负离子模式(SIM-Q1MS)，参数：毛细管温度 270 ℃，气化器温度 400 ℃，鞘气压力20 kPa，辅助气压力5 kPa，喷雾电压 5 000 V(+)/4 000V(-)。

1.4.3 尿素 液相色谱：色谱柱Thermo Accucore C18(柱长100 mm×内径2.1 mm，粒径2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃。

质谱：电喷雾电离-正离子模式(SRM)，参数：毛细管温度252 ℃，气化器温度300 ℃，鞘气压力10 kPa，辅助气压力2 kPa，喷雾电压4 500 V(+)/4 000 V(-)。

1.5 阿特拉津降解基因的筛选与克隆

参考前期降解基因转录组测序结果进行分析和比较，筛选出6个与阿特拉津降解有关的基因，分别为L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA[9]。各基因产物及位置等信息见表2。

表2 阿特拉津降解基因Tab.2 Atrazine degradation gene

采用PCR扩增技术对阿特拉津降解基因进行克隆。细菌总DNA提取采用CTAB法[15]。反应体系为50 μL，其中包括引物(表3)5 μL、DNA模板1 μL、dNTPs 5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、缓冲液5 μL、双蒸水33.5 μL。

PCR反应条件为：94 ℃，预变性5 min，设35个循环(94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，在此基础上72 ℃延伸10 min，4 ℃稳定4 min。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，EB(溴化乙锭)染色10 min，凝胶图像系统(上海天能科技有限公司)观察目标条带。采用TIAN rapid Midi Purification试剂盒(天根生物科技有限公司)回收目标条带，送至金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.6 阿特拉津降解基因GO功能富集分析

对筛选出的降解基因进行GO功能富集分析，结合GO注释结果推测降解基因的功能。

表3 降解基因的引物名称及序列 Tab.3 Primer names and sequences of degrading genes

2 结果与分析

2.1 阿特拉津降解率与降解产物的测定结果

经液相色谱与质谱联用技术测定菌株Enterobactersp.在48 h内降解率高于90%，是理想的高效降解菌株[9]。降解阿特拉津120 h后的关键中间代谢产物为羟基阿特拉津、氰尿酸以及尿素。待测样本运行9 min，出峰时间为4.75 min，离子质荷比为156.1 m/z(图1、2)，成功检测出羟基阿特拉津。待测样本运行5 min，出峰时间为1.07 min，离子质荷比为128.0 m/z(图3、4)，成功检测出氰尿酸。待测样本运行9 min，出峰时间为0.26 min(图5)，离子质荷比为44.5 m/z，如(图6)，成功检测出尿素。

图1 羟基阿特拉津总离子图谱Fig.1 Total ion map of hydroxyatrazine

图2 羟基阿特拉津质谱图Fig.2 Mass spectrogram of hydroxyatrazine

图3 氰尿酸质谱图 Fig.3 Mass spectrogram of cyanuric acid

图4 氰尿酸总离子图谱Fig.4 Total ion map of cyanuric acid

图5 尿素总离子图谱Fig.5 Total ion map of urea

图6 尿素质谱图 Fig.6 Mass spectrogram of urea

2.2 阿特拉津降解基因的测定结果

通过GO富集分析降解基因L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA，更好地了解降解基因相关的生物学功能。并结合PCR扩增技术，先后扩增出长度为1 020 bp的α/β水解酶基因L465-RS09425、长度为1 080 bp的单加氧酶基因L465-RS10465、长度为1 380 bp的鸟嘌呤脱氨酶基因L465-RS12445、长度为900 bp的MBL折叠金属水解酶基因L465-RS09100、长度为480 bp的嘧啶利用蛋白基因L465-RS12200和长度为360 bp的脲酶基因UreA(图7)。

图7 阿特拉津降解基因PCR扩增产物电泳图谱Fig.7 Electrophoresis map of amplified products of atrazine degrading genes by PCR

2.3 阿特拉津的降解途径分析

结合各阿特拉津降解基因的作用(表4)，初步分析阿特拉津降解途径可能为图8所示。在降解产物中检测到羟基阿特拉津、氰尿酸、尿素,可以推测具体降解过程可能为，在基因L465-RS09425作用下发生水解反应，阿特拉津脱氯为羟基阿特拉津，该水解酶基因功能与前人发现的AtzA、TrzN基因功能相似[16-21]；羟基阿特拉津经基因L465-RS10465作用，连续脱2次烷基，转化为氰尿酸二酰胺，这一作用基因与前人发现的AtzB基因的功能相似[22]；在基因L465-RS12445的作用下发生脱氨基反应生成氰尿酸；氰尿酸在基因L465-RS09100作用下开环产生脲基二甲酸；随后嘧啶利用蛋白基因L465-RS12200使脲基二甲酸发生脱羧反应进而生成下一

表4 阿特拉津降解基因GO富集分析Tab.4 GO enrichment analysis of atrazine degrading genes

阶段的产物——尿素；最后，尿素在尿酶辅助蛋白基因UreA的作用下生成CO2、H2O和NH3。在目前已知的降解菌株中，只有少部分能将阿特拉津完全降

解为NH3、H2O和CO2[20-21]，大部微生物只能将其转化为中间代谢产物，如羟基阿特拉津[23-24]、氰尿酸[25-27]、缩二脲、乙酰胺等。

图8 阿特拉津降解途径 Fig.8 Atrazine degradation pathway

3 结论与讨论

随着研究的深入，发现菌株Enterobactersp.降解阿特拉津的过程与王辉等[28]总结的阿特拉津微生物代谢过程不同。这是因为，微生物的代谢方式是多样的，相同微生物作用同一底物，会存在多条代谢路径，正是这一特点奠定了微生物强大的环境适应能力[29]。这与细菌环境适应性强、具有多样化的代谢方式相符合，更利于生物功能进化。本研究通过液相色谱与质谱联用技术检测阿特拉津降解产物，并用PCR技术对基因克隆，同时进行基因功能比对，推测出其降解路径。当阿特拉津降解时，菌株Enterobactersp.在L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA共6种基因控制的α/β水解酶、烷烃1-单加氧酶、鸟嘌呤脱氨酶、MBL金属水解酶、嘧啶利用蛋白C、脲酶亚单位γ作用下，先后生成了羟基阿特拉津、氰尿酸二酰胺、氰尿酸、脲基二甲酸和尿素5种中间体。在试验中得知，菌株Enterobactersp.为革兰氏阴性菌，可以将阿特拉津完全矿化[30]。初步推测菌株Enterobactersp.在降解基因的作用下，经脱氯、脱烷基、脱氨基、环裂解、脱羧和脲基甲酸水解等过程，将阿特拉津逐步矿化。菌株Enterobactersp.可以将阿特拉津完全矿化为NH3、H2O和CO2。有关新基因的功能分析，还需要进一步采用基因敲除和降解率测定等方法进行功能验证。