硫化氢对大豆铝胁迫耐受性的增强作用

刘文文，纪 芳，王华华

(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)

铝毒是酸性土壤中限制农业生产的最主要逆境因子。当土壤pH值<5.5时，结合态的铝以Al3+的状态释放进土壤溶液中，对植物产生毒害[1]。铝毒最显著的特征是抑制植物根尖的伸长，影响植物对水分及营养物质的吸收，从而导致植物生长受到抑制，造成农作物减产。正常情况下，植物体内活性氧(ROS)的生成和清除处于动态平衡。当ROS浓度超过正常水平时，即对细胞构成氧化胁迫。铝毒可引起植物体内ROS过量积累，从而导致植物细胞遭受氧化伤害[2]。为了减轻和防止ROS造成的氧化损伤，植物体内也存在着相应的氧化应激机制。其中，抗氧化酶系统是清除ROS的重要机制，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)等。

硫化氢(H2S)是继NO和CO之后新发现的一种内源性气体信号分子。因其毒性以及对植物生长发育某些方面的不利影响，H2S长期以来一直被认为是一种植物毒素[3]。近些年来，H2S在植物中的多种生理学功能才逐渐被重新认识。研究表明，H2S作为信号分子参与调控植物的生长发育过程，如种子萌发、根器官的形成、气孔运动等[4-6]；此外，H2S还参与了植物对多种胁迫环境的响应，如盐胁迫、缺氧胁迫、重金属胁迫等[7-10]。尽管H2S参与植物逆境胁迫的响应已有一些报道，但关于H2S在铝毒中的调节作用及其调控机制尚不太清楚。鉴于此，利用H2S供体和抑制剂处理，探讨了H2S在大豆耐铝性中的调节作用及其机制，为进一步揭示大豆抗铝毒胁迫信号网络调控机制及筛选和培育抗铝毒大豆品种提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料及培养

供试大豆种子(JD39)由甘肃省农业科学院提供。选取大小一致的大豆种子，用清水浸泡后均匀放置在充分吸水的海绵上，种子表面覆盖一层湿润的纱布，28 ℃恒温培养箱黑暗培养48 h后，挑选根长约2 cm的大豆，于1/4Hoagland培养液中培养3 d，培养条件：温度25 ℃，光强150 μmol/(m2·s)，相对湿度70%，光/暗周期14 h/10 h。

1.2 试验方法

1.2.1 铝胁迫浓度筛选 采用AlCl3(下文以Al表示)模拟铝胁迫处理。选取长势一致的大豆幼苗转入新鲜的1/4Hoagland营养液中培养24 h后，分别移入到含0、25、50、100、200、500 μmol/L Al的营养液中处理24 h，测定根伸长量。

1.2.2 铝胁迫时间筛选 选取长势一致的大豆幼苗转入新鲜的1/4Hoagland营养液中培养24 h后，移入到含100 μmol/L Al的1/4Hoagland营养液中分别处理0、6、12、24 h，测定根尖H2S含量。

1.2.3 铝胁迫下H2S对大豆生长发育及生理指标的影响 选取长势一致的大豆幼苗转入新鲜的1/4Hoagland营养液中培养24 h后，分别进行以下处理：对照(CK)、NaHS(H2S供体)、HA(H2S抑制剂)、Al、Al+NaHS和Al+HA，处理时间为24 h，NaHS和HA处理添加浓度分别为25 μmol/L和100 μmol/L，Al处理浓度均为100 μmol/L，CK为正常1/4Hoagland营养液培养。处理后收集主根用于各项指标的测定。

1.3 测定项目及方法

1.4 数据处理

每个处理至少重复3次，数据结果采用平均值±标准误表示。用SPSS 18.0软件分析数据，采用单因素LSD法进行显著性分析(P<0.05)，运用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Al对大豆根伸长的影响

根尖是植物感知铝毒害的最主要部位，根伸长量是反映植物遭受铝毒害程度的关键指标。由图1A可见，随着铝浓度升高，大豆根伸长量逐渐降低，当铝浓度为100 μmol/L时，根伸长量降低33.0%，而当铝浓度升高到500 μmol/L时，根的伸长则受到严重抑制，根伸长量降低71%。如图1B所示，铝处理不仅抑制了主根的生长，对侧根生长也具有明显的抑制作用，当铝浓度达到100 μmol/L时，侧根的数量及长度明显减少，铝浓度进一步增加，侧根基本不再生长。根据试验结果，选取100 μmol/L Al进行后续试验。

2.2 铝胁迫不同时间对大豆根尖H2S产生的影响

为了探究内源H2S是否参与了大豆对铝胁迫的响应，检测了铝胁迫下根尖内源H2S含量的变化情况。如图2所示，100 μmol/L Al处理6 h根尖H2S含量显著增加，随着Al处理时间的延长，根尖内的H2S含量逐渐升高，处理24 h根尖H2S含量约为处理0 h的3.3倍，表明铝处理诱导了根尖内源H2S的产生。

不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同

图2 铝胁迫处理不同时间对大豆根尖H2S含量的影响 Fig.2 Changes of H2S content in soybean root tips under Al stress for different time

2.3 铝胁迫下H2S对大豆根伸长量及根尖相关生理指标的影响

2.3.1 根伸长量 根伸长受抑制程度是反映植物所受铝毒害程度的重要指标。如图3所示，100 μmol/L Al处理24 h后，根伸长量较CK降低约35.0%； Al+NaHS处理显著缓解了铝胁迫对根伸长的抑制作用，根伸长量较Al处理提高约36.7%，而Al+HA处理则进一步加重了铝胁迫对根伸长的抑制作用，根伸长量较Al处理降低约24.8%。这些结果表明，H2S缓解了铝胁迫对大豆根伸长的抑制作用。

图3 铝胁迫下H2S供体和抑制剂对大豆根伸长的影响 Fig.3 Effect of H2S donor and inhibitor on root elongation of soybean under Al stress

2.3.2 根尖铝含量 根尖铝含量的积累与植物铝毒害有关。如图4所示，与CK相比，100 μmol/L Al

图4 铝胁迫下H2S供体和抑制剂对大豆根尖铝含量的影响Fig.4 Effect of H2S donor and inhibitor on Al content in soybean root tips under Al stress

处理24 h后，大豆根尖中吸收了大量的铝，Al+NaHS处理根尖中的铝含量显著下降，较Al处理下降23.5%；而Al+HA处理根尖吸收的铝含量进一步增加，较Al处理增加34.8%。这些结果表明，铝胁迫下H2S降低了根尖铝含量的积累，从而缓解了铝毒害。

2.3.3 根尖细胞死亡率 铝胁迫会导致根尖细胞死亡。如图5所示，Al处理后，根尖细胞出现了明显的死亡，细胞死亡率较CK增加了近2倍。Al+NaHS处理显著降低了根尖细胞死亡率，而Al+HA处理则进一步提高了根尖细胞死亡率。这些结果表明，H2S可以缓解铝胁迫造成的根尖细胞死亡情况。

图5 铝胁迫下H2S供体和抑制剂对大豆根尖细胞死亡率的影响Fig.5 Effect of H2S donor and inhibitor on cell death in soybean root tips under Al stress

图6 铝胁迫下H2S供体和抑制剂对大豆根尖MDA含量的影响Fig.6 Effect of H2S donor and inhibitor on MDA content in soybean root tips under Al stress

图7 铝胁迫下H2S供体和抑制剂对大豆根尖H2O2(A)和含量的影响Fig.7 Effect of H2S donor and inhibitor on H2O2(A)和 contents in soybean root tips under Al stress

2.4 铝胁迫下H2S对大豆抗氧化酶活性的影响

如图8所示，100 μmol/L Al处理24 h后，大豆CAT、APX、POD活性分别较CK提高59.0%、22.0%、13.0%；Al+NaHS处理进一步提高了CAT、APX、POD活性，与Al处理相比分别增加21.0%、30.0%、17.0%；而Al+HA处理CAT、APX、POD活性显著下降。大豆SOD活性在Al处理后有所下降，但是Al+NaHS处理则显著提高了SOD活性，而Al+HA处理则进一步降低了SOD活性。这些结果表明，铝胁迫下H2S可以通过提高抗氧化酶活性来清除过多的活性氧，增强大豆抵抗铝毒害的能力。

图8 铝胁迫下H2S供体和抑制剂对根尖抗氧化酶活性的影响Fig.8 Effect of H2S donor and inhibitor on the activities of antioxidant enzymes in soybean root tips under Al stress

3 结论与讨论

综上，铝胁迫诱导大豆根尖ROS的积累，造成根尖膜脂过氧化，使根尖伸长受到抑制，导致大豆根生长抑制。H2S通过提高大豆幼苗根尖抗氧化酶活性，清除多余的ROS积累，减轻铝毒害诱导的氧化胁迫，缓解其造成的大豆根系生长受抑。