麦冬多糖的提取分离及含量测定

何锋　陆小兰　滕宝松

【摘  要】目的：将传统提取工艺与膜分离技术联用对麦冬多糖进行分离纯化，并考察其多糖含量。方法：采用L₉（4³）正交试验对麦冬多糖的提取工艺进行优化;采用不同分子量级别的超滤膜对麦冬多糖进行精制分离研究。结果：麦冬多糖最佳提取条件为95°C，提取2次，每次2h。Sevage法蛋白脱除率高。检测了超滤膜分级研究所得的各组分多糖含量。结论：本研究优选的工艺在技术上是合理的、可行的，合适的超滤膜可以将麦冬多糖进行很好的分级纯化。

【关键词】麦冬;膜分离;多糖

【中图分类号】R914;R96      【文献标识码】A      【文章编号】1004-7484（2020）09-0296-02

Extraction， separation and content determination of Polysaccharide from Ophiopogon japonicus

【Abstract】Objective：The polysaccharide of Ophiopogon japonicus was separated and purified by the combination of traditional extraction technology and membrane separation technology， and the content of polysaccharide was investigated.MethodsL9 （4³） orthogonal test was used to optimize the extraction process of Ophiopogon japonicus polysaccharide. The purification and separation of Polysaccharide from Ophiopogon japonicus was studied by ultrafiltration membrane with different molecular weight.ResultThe best extraction condition of Ophiopogon japonicus polysaccharide was 95 °C， 2 times， 2 hours each time. High protein removal rate of Sevage method. The content of polysaccharide in each component of ultrafiltration membrane was determined.ConclusionThe optimal technology of this study is reasonable and feasible， and the suitable ultrafiltration membrane can carry out a good classification and purification of Ophiopogon japonicus polysaccharide.

【Key words】Ophiopogon japonicus; Membrane separation; polysaccharides

中藥麦冬（Ophiopogon japonicus （Linn. f.） Ker-Gawl.）为百合科沿阶草属多年生常绿草本植物干燥块根，味苦、微苦、性微寒。入心、肺、胃经。有养阴生津，润肺清心^[1]的功效，是中医药宝库中的珍品。现代医学研究发现，麦冬的化学成分比较丰富，含有多糖、甾体皂苷、高异黄酮类、氨基酸等。具有多种药理作用，能够增加机体耐缺氧能力;降血糖，促进胰岛细胞的恢复;提高机体免疫能力等作用^[2]。

膜分离技术是一项新型的高效分离技术，它是在分子水平上，不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，选择性分离的技术，根据膜上小孔的实际大小，可将其分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等^[3]。目前已被广泛应用于医药、食品及环保水处理等各个领域^[4-5]。膜分离技术以选择性透过膜为分离递质，当膜两侧存在一定电位差、浓度差或压力差时，原料一侧的组分就会选择性地透过膜，从而实现大、小分子的分离，达到有效成分净化浓缩的目的^[6-8]。

超滤技术是膜分离技术的一种，是以0.1～0.5 MPa的压力差为推动力，利用多孔膜的拦截能力，以物理截留的方式，将溶液中不同大小的物质颗粒分开，从而达到纯化和浓缩、筛分溶液中不同组分的目的 ^[9]。 超滤主要用于从液相物质中分离大分子化合物（蛋白质，核酸聚合物，多糖，天然胶等），胶体分散液（粘土，颜料，矿物料，孔液粒子，微生物），乳液（润滑脂-洗涤剂以及油-水乳液）。其操作静压差一般为0.1-0.5MPa，被分离组分的直径大约为0.01-0.1μm，一般为分子量范围0.5KDa-1000KDa的大分子和胶体粒子^[10-11]。

1仪器与材料

UV-2600/2700紫外可见分光光度计，日本岛津;W201型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司;LGJ-10D冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司;TGL-20B离心机，上海安亭科学仪器;LNG-HFM-10实验室膜分离设备，上海朗极膜分离设备工程有限公司;1000KDa、500KDa、100KDa、30KDa超滤膜，上海朗极膜分离设备工程有限公司;1KDa透析袋，上海源叶生物科技有限公司。

麦冬干燥块根购自绵阳市川诚豪宇麦冬开发有限责任公司;95%乙醇、浓硫酸、氯仿和正丁醇购自上海振兴化工一厂;苯酚购自江苏永华精细化学品有限公司;葡萄糖购自北京华尔博科技有限公司;Tris购自上海希美生物科技有限公司;Lowry蛋白定量试剂盒购自上海荔达生物科技有限公司;柠檬酸购自上海科兴生物科技有限公司;柠檬酸钠购自上海佳伦生物科技有限公司;水为纯化水。

2方法与结果

2.1多糖含量的测定

1）制作标准曲线：准确称取葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8 mL，各以水补至2mL，然后加入6%苯酚1mL，静止10min，然后加入浓硫酸5mL，摇匀，室温放置20min后于490nm测光密度，以2mL水按同样操作为空白，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线Y = 0.2904X+ 0.0271， R²=0.9953，线性范围为0.025～0.150mg/mL。

2）样品含量测定：吸取样品液1mL（相当于40μg左右的多糖），加水1mL，然后加入6%苯酚1mL，静止10min，然后加入浓硫酸5mL，摇匀，室温放置20min后于490nm测光密度，以标准曲线计算多糖含量。

2.2蛋白含量的测定

1）制作标准曲线：准确配置浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液0.5mL，加入试剂A （含Cu²⁺的碱性试剂）2.5mL，混匀后室温放置10min。各管加入试剂B（酚试剂即磷钨酸-磷钼酸不用稀释，直接使用）0.25mL，每加一管必须立即混匀，室温放置30min，然后在650nm波长处测定光吸收，以横坐标为蛋白浓度，纵坐标为光密度值，得标准曲线Y =13.866X+ 0.0668，R²=0.9943。

2）样品含量测定：各管加入待测溶液0.5mL，空白对照用0.5mL生理盐水或蒸馏水来替代待测溶液。各管加入试剂A 2.5mL，混匀后室温放置10min，各管加入试剂B 0.25mL。

2.3多糖的提取

2.3.1工艺流程

麦冬块根干品用粉碎机粉碎，称取10g麦冬粉碎后样品，以蒸馏水作為溶剂，按一定浸提温度、浸提时间和浸提次数进行浸提，冷却滤过，合并滤液，离心弃沉淀得上清液，上清液经浓缩后，加入4倍量95%乙醇进行沉淀，静置过夜。离心所得沉淀加适量水溶解，Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4：1）除蛋白3次，将脱蛋白后粗多糖用膜分离技术进行纯化精制。

2.3.2单因素试验

参照“2.3.1”项工艺流程，每次称取10g麦冬粉碎后样品，考察浸提温度、浸提时间和浸提次数对麦冬多糖提取率的影响。

2.3.2.1浸提温度对多糖提取率的影响

在浸提时间2h，提取2次的条件下，考察不同浸提温度55°C、75°C、95°C对麦冬多糖提取率的影响，结果分别为2.78%、5.43%、7.67%。可以看出随着温度的升高，多糖提取率也随之提高。

2.3.2.2浸提时间对多糖提取率的影响

在浸提温度95°C，提取2次的条件下，考察不同浸提时间1h、2h、3h对麦冬多糖提取率的影响，结果分别为3.77%、7.65%、8.23%。可以看出随着浸提时间的延长，多糖提取率不断升高，但当浸提时间大于2h，多糖提取率增加幅度降低。

2.3.2.3浸提次数对多糖提取率的影响

在浸提温度95°C，浸提时间2.0h条件下，按照浸提次数为1、2、3次对麦冬多糖提取率的影响，结果分别为4.31%、7.63%、7.95%。可以看出随着浸提次数的增加，多糖提取率不断升高，当浸提次数大于2次时，提取率升高幅度不大。

2.3.3正交试验

在单因素试验的基础上，以多糖提取率为考察指标，进行3因素3水平L₉（4³）正交试验，考察浸提温度（A）、浸提时间（B）和浸提次数（C）对多糖提取率的影响，实验设计和结果见表1。由表1可知，3个因素对麦冬多糖提取率的影响依次为浸提次数>浸提温度>浸提时间。最优工艺为A₃B₂C₂，即浸提温度95°C，浸提时间2h，浸提次数2次。

2.4脱蛋白实验

Sevage法：取3g多糖粗粉溶解成25mL多糖水溶液，按多糖水溶液-氯仿-正丁醇=25：24：1的比例充分混合后萃取3次，得上清液，浓缩冷冻干燥后得脱蛋白后多糖。用Lowry法检测后证明脱蛋白前多糖粗粉蛋白含量为17.86%，脱蛋白后蛋白含量为1.47%，脱除率高达91.8%。

2.5麦冬多糖超滤膜分离研究

超滤膜分离的关键在于膜型号的选择。本实验选择1000KDa、500KDa、100KDa、30KDa分子量级别的超滤膜将麦冬多糖进行分级纯化。

将麦冬脱蛋白后的粗多糖配成质量浓度为0.05g/mL水溶液1L，先经1000KDa超滤膜超滤分离，1L料液结束后用纯化水顶洗0.5L，得1.4L透过液和0.1L浓缩液（F1），将透过液全部进行500KDa超滤膜超滤分离，并加水顶洗0.7L，得2.0L透过液和0.2L浓缩液（F2），然后将透过液全部进行100KDa超滤膜超滤分离，并加水顶洗1L，得2.7L透过液和0.3L浓缩液（F3），然后将透过液全部进行30KDa超滤膜超滤分离，并加水顶洗1.5L，得0.5L浓缩液（F4）和3.7L透过液，取1L透过液用1KDa透析袋透析除盐并旋蒸浓缩得组分F5。将F1-F5组分分别冷冻干燥，称定质量，计算得率（）。用苯酚硫酸法检测超滤分级得到的各组分多糖含量。结果见表2。

3讨论

麦冬自古以来就为人们所熟知，有养阴润肺、益胃生津、清心除烦等功效。本实验将麦冬多糖传统水提醇沉工艺与超滤膜分离技术相结合，对麦冬多糖进行了精制分离。结果表明麦冬多糖水提工艺最佳條件为提取温度95°C，提取2次，每次2h。Sevage法蛋白脱除率高，而且操作方法简单、稳定，能保证麦冬多糖的稳定提取。

综上所述，相比于传统工艺，超滤膜分离技术在多糖的分离纯化中具有独特的优势。在运作过程中无相变、无化学反应可在最大程度上保留多糖活性。但膜分离过程中膜组件和膜清洗繁琐等问题还需要进一步研究优化。

参考文献

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