聚酰胺柱层析法测定一种保健酒/椰岛牌海王酒中总黄酮

蒲小兰　吴炜　林书兰　王晓玉　王娃金

【摘  要】采用聚酰胺柱层析法分离总黄酮，紫外分光光度法检测椰岛牌海王酒中的总黄酮。将酒样加聚酰胺吸附，水浴挥干乙醇，转入层析柱，用甲醇洗脱黄酮，在波长360nm处测定其含量。芦丁标准品浓度范围在30?g/mL范围内具有良好的线性关系，相对标准偏差为1.8%，加标回收率在97～102之间。结果表明，本检测方法操作简便、稳定性好。

【关键词】总黄酮;保健酒;聚酰胺柱层析;紫外分光光度法

【中图分类号】R151      【文献标识码】A      【文章编号】1004-7484（2020）09-0270-02

1材料与方法

1.1仪器

岛津UV—1800型紫外分光光度计;十万分之一天平（Sartorius BP211D）;千分之一天平（上海恒平电子天平 JA5003）;超声波洗器（上海科导超声仪器有限公司）;数显恒温水浴锅（常州奥化仪器有限公司）;旋转蒸发仪（RE-2000）;层析柱（1.5 × 50cm）、容量瓶（10 mL，25 mL，50 mL）、移液管（1mL，2 mL，5 mL）、蒸发皿、脱脂棉花。

1.2试剂

除非另有说明，本实验所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。

芦丁对照品（含量92.5%）购自中国食品药品检定研究院（批号100080 - 200707），供UV法检查用;聚酰胺（80～100目，柱层析FCC，国药集团化学试剂有限公司）;甲醇（国药集团化学试剂有限公司）;乙醇（95%，广东光华科技股份有限公司）;氢氧化钠（广东光华科技股份有限公司）;冰醋酸（西陇化工股份有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1标准曲线的制作

精密称取在103+1℃下干燥至恒重的芦丁对照品2.50mg至50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL含有46.25μg（按92.5%折算）的芦丁标准储备溶液。精密吸取该芦丁标准储备溶液0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，于360nm波长处测定吸光度值，求回归方程，用以计算试样中总黄酮含量。

1.3.2样品的制备

1.3.2.1聚酰胺的预处理

购买的聚酰胺先用80目不锈钢筛子筛除大于80目的部分，然后用100目不锈钢筛子筛除小于100目的部分，取80～100的聚酰胺，用适量90%～95%乙醇浸泡聚酰胺，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中。用3～4倍体积的90%～95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣），然后用水洗脱至无醇味。再依次用2～2.5倍体积的5%NaOH溶液，1倍体积的水，2～2.5倍体积的10% 醋酸溶液洗脱，最后用蒸馏水洗至流出液pH为中性;最后将处理好的聚酰胺置于60 ℃烘干，备用。

供试品溶液的制备

准确吸取2mL保健酒样于蒸发皿中，加入1.5g经过预处理的聚酰胺粉（80～100目）吸附，于水浴70 ℃挥干溶剂，转入层析柱中，用50 mL甲醇洗脱（流速为2～3s/d），洗脱液减压浓缩后转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得。

1.3.3样品含量的测定

取上述供试品溶液，以相应试剂为空白，在360nm波长处测定吸光度值，对比标准曲线，计算试样中总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1聚酰胺预处理必要性的考察

分别吸取2 mL酒样 6份于6个蒸发皿，分为两组，每组3份，一组加入1.5g处理过的聚酰胺粉（30～60目），另一组加入1.5g未经处理的聚酰胺粉（30～60目）进行吸附，于水浴70 ℃挥干溶剂，然后转入层析柱中。先用40 mL苯洗，洗脱液弃去，再用50 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩后转移至25mL容量瓶中，用甲醇定容。于360 nm波长测定吸光度。结果见表1

经成组双侧t检验，t= 15.584，t > t（0.05，4）=2.776，P < 0.05，即聚酰胺的处理与否对总黄酮含量测定结果有显著性影响，故市售聚酰胺需经过预处理才能用于供试品溶液的制备。

2.2聚酰胺粒径的筛选

准确吸取2mL酒样于蒸发皿中，加不同粒径的聚酰胺粉1.5g吸附，于70℃挥干溶剂，然后转入层析柱中。用50 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩后转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容。于360 nm波长测定吸光度。重复3次，结果见表2。

由表4可以发现，聚酰胺的粒径对总黄酮含量测定结果有显著性影响，粒径为80～100目的分离富集效果最佳，因此，选择粒径为80～100目的聚酰胺进行柱层析。

2.3样品预处理必要性的考察

量取一定量酒样于25 mL容量瓶中，超声20 min，静置。吸取2mL于蒸發皿中，加1.5g聚酰胺粉（30～60目）吸附，于水浴70℃挥干，然后转入层析柱中。用50 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩后转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，重复制备样品3份。另取3份样品，不经超声预处理，直接上样，按上述方法处理，于360 nm波长测定吸光度，结果如表3所示。

经成对资料双侧t检验，t = 3.051，t < t（0.05，2）=4.303，P > 0.05，即样品超声与未超声测定的吸光度无明显差异。所以，取样时不需要经过超声处理。

2.4样品取样量的筛选

分别量取一定量的酒样，用乙醇稀释不同的倍数，准确吸取一定的量，加入聚酰胺（30～60目）进行吸附，于水浴70℃挥干，然后转入层析柱中，采用不同体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩，转移至容量瓶中，用甲醇定容，测定吸光值。样品取样量，稀释倍数，聚酰胺用量，甲醇用量，最终定容体积及吸光值见表4

由表中的結果可以发现，样品不稀释直接进行聚酰胺柱层析，可以达到紫外-可见风光光度法对吸光值在0.3～0.7范围内的要求，考虑到供试品溶液制备过程中试剂、试药的用量及批量检测的效率，取样量定为2 mL，最终定容体积为25 mL，其它参数另外考察。

2.5样品取样量与聚酰胺用量之间关系的考察

准确吸取样品溶液B（2） 2mL于蒸发皿中，加不同比例地聚酰胺粉吸附，于水浴70℃挥干，然后转入层析柱中。用50 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩后转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容。于360 nm波长测定吸光度。重复3次。另取1g和2g聚酰胺各三份，按上述方法处理。结果见表5

由表5可以看出，聚酰胺用量为1g和1.5g，检测的吸光值均大于用量为2.0g的吸光值，用量为1g和1.5g的吸光值无差异，但实验过程中发现，采用1g聚酰胺吸附时，易出现黏附在蒸发皿的现象，因此，设定聚酰胺的用量为1.5 g。

2.6水浴温度的考察

分别量取样品B（2） 2 mL于不同的蒸发皿中，加入1.5 g 聚酰胺吸附，于水浴上（设置不同的水浴温度见表6）挥干，然后转入层析柱中。用50 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩后转移至25mL容量瓶中，用甲醇定容。于360nm波长测定吸光度。每个温度重复制备3份，对结果进行单因素方差分析，见表7

由表7可以发现，设定的水浴温度对总黄酮含量测定结果无显著性影响，当水浴温度为70℃时，水浴挥干时间约30 min，有利于操作。因此，设定水浴温度为70℃。

2.7除杂剂的筛选

分别吸取2mL样品B（2）于蒸发皿中，加1.5g聚酰胺粉吸附，于水浴70℃挥干，然后转入层析柱中。方法一：先用20 mL苯洗，洗脱液弃去，再用50 mL甲醇洗脱;方法二：先用20mL 石油醚洗脱，洗脱液弃去，再用50 mL甲醇洗脱;方法三： 直接用50 mL甲醇洗脱。洗脱液浓缩后转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，于360nm波长测定吸光度。每种除杂剂平行制备样品3份。结果如表8所示。

经统计分析t 检验，苯洗脱与不除杂之间的t为0.711， 苯洗脱与石油醚洗脱的t为1.650，t0.05，所以，样品除杂与不除杂，对总黄酮的含量测定无显著性差异，考虑对操作者的环保及劳动保护，因此，供试液制备不经除杂剂洗脱。

2.8洗脱剂用量的考察

准确吸取2mL样品B（2）于蒸发皿中，加1.5g聚酰胺粉吸附，于水浴70℃挥干，然后转入层析柱中。用甲醇洗脱，每10 mL收集一次，对洗脱液进行Alcl3反应，同时于波长360 nm处测定每一瓶洗脱液的吸光值。结果发现：洗脱至30 mL，Alcl3反应结果几乎为阴性，洗脱曲线表明当洗脱体积为45 mL 时，洗脱完全。洗脱曲线见图1

为了确定最终洗脱体积，我们设选取了45 mL前后的3个体积（40、50、60mL）进行验证，结果如表9所示，

由表9可以看出当洗脱剂甲醇的用量达到50 mL时，样品中总黄酮能够被洗脱完全。因此，设定甲醇的洗脱体积为50 mL。

2.9洗脱流速的考察

分别准确吸取样品B（2）2mL于不同的蒸发皿中，加入1.5g聚酰胺吸附，于水浴70℃挥干，然后转入层析柱中。用甲醇50 mL洗脱，设置不同的流速（见表10），洗脱液减压浓缩后转移至25 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，此液在360 nm处测定吸光度，对结果进行单因素方差分析，进行F 检验，结果见11.

由方差分析结果可以看出，洗脱流速对含量测定结果有显著性影响，我们对5种流速进行了两两比较，进行q检验，结果发现不同的流速组有差别，其中流速为2-3 s/d 结果最好，因此，柱层析流速为2-3 s/d。

2.10检测波长的选择

精密称取芦丁标准品2.83g（含量92.5%）至50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为52.355?g/mL的芦丁标准储备液芦丁标准溶液。以此溶液进行全波长扫描，发现在360 nm处有最大吸收，因此选择360 nm作为测定波长。图谱如图2

2.11标准曲线和线性范围

分别准确移取芦丁标准溶液（52.355μg/mL）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。于波长360 nm处测定吸光度，以吸光度（A）对芦丁标准溶液浓度（?g/mL）进行线性回归，得到标准曲线y=0.0316x-0.0024，r=0.99995，数据见表1，标准曲线见图2。由试验结果可知，芦丁在5.2355 ～26.1775?g/mL范围内，呈良好线性关系。

2.12方法的检出限

2.12.1检出限和定量限的确定

把3倍空白值的标准偏差相对应的质量作为检出限。其中吸光法的检出限L = 3 s/b。s 为空白值的标准偏差，b 为标准曲线回归方程的斜率。20次全试剂空白值的标准偏差为0.0079，标准曲线回归方程的斜率为0.0316，由此计算出该方法的检出限为0.75?g。

2.12.2检出限的验证

直接取0.5mL芦丁标准储备液（52.355?g/mL）至25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得浓度为1.0471?g/mL的溶液，于360nm波长处测定吸光度为0.03445，根据回归方程y=0.0316x-0.0024计算浓度为1.1519?g/mL，说明该方法检出限设置合理。

2.13精密度试验

取一份B（2）样品，按“3检测方法”所述方法处理，连续测定6次，结果见表3。

结果表明，该方法精密度良好。

2.14重复性试验

取编号为B（2）的样品，按“3检测方法”所述方法处理，平行处理制备6份，分别测定吸光度，结果见表2。

结果表明，该方法重复性良好。

2.15稳定性试验

取一份B（2）样品，按“3检测方法”所述方法处理，样品制备完成后，分别在0、15、30、60、90、120 min，测定吸光度，每次测定后，容量瓶用封口胶封口并保存于冰箱中。结果见表4。

结果表明，样品溶液在120 min内稳定。若样品处理好后无法及时上机测定，容量瓶应用封口胶封口并保存于冰箱，且应在120min内完成上机测定。

2.16重现性试验

由两名实验人员按“3检测方法”所述方法对样品B（2）进行处理，每人平行操作3份，测定吸光度，结果见表5。

由表5可以看出，不同人员采用该方法对同一样品进行处理，各自的平均吸光度分别为0.329及0.332，吸光度值相差0.003，差异极小，平均RSD为1.27%，由此说明，该方法重现性较好。

2.17回收率试验

吸取2 mL已知含量的B（2）样品（总黄酮含量为13.33mg/100mL，由多次测量的平均值计算所得）6份，按样品含量的100%加入芦丁标准溶液（浓度为），按“3检测方法”所述方法处理，于360nm波长处测定吸光度，结果如表6所示。

加标回收试验结果表明，该方法准确度高，方法可靠。

讨论：

1.聚酰胺的粒径筛选，粒径对总黃酮含量测定结果有显著性影响，粒径为80～100目的分离富集效果最佳;

2.试剂筛选对样品除杂与不除杂，对总黄酮的含量测定无显著性差异，考虑对操作者的环保及劳动保护，因此，供试液制备不经除杂剂洗脱。

参考文献

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[2]王 琳·保健酒中总黄酮的含量测定·药品鉴定·2012 年 3 月第 19 卷第 9 期.

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