木蹄层孔菌产锰过氧化物酶的碳氮源优化及酶学性质

尚洁

摘要：锰过氧化物酶是环境工程研究领域广泛关注的酶之一，它能够促进生物燃料合成，促使木质素和污染物降解等工业生物过程更好进行。研究木蹄层孔菌产锰过氧化酶的最适碳源和氮源，揭示锰过氧化物酶的培养方式、最适pH值和pH耐受性、最适温度和温度耐受性、金属离子对其影响等特征。木蹄层孔菌在静置培养时产锰过氧化物酶显著高于振荡培养。小麦麸皮23 g/L和蛋白胨2 g/L是最佳组合的碳源和氮源。锰过氧化物酶在pH值为4.5或温度为50 ℃时酶活力最高。酶在pH值4.0～4.5或温度30 ℃以下处理24 h后，仍可保持80%以上的酶活力。底物为愈创木酚时，锰过氧化物酶的Km值为0.34 mmol/L，Vmax为0.12 mmol/L·min。当添加的金属离子浓度为1 mmol/L，与对照相比，K+、Ca2+、Ba2+、Co2+和Na+可极显著抑制MnP活力。当添加的金属离子浓度为10 mmol/L，与对照相比，除Mg2+外，其他金属离子均能极显著抑制酶的活力。Mg2+ 1、10 mmol/L对酶的活力没有影响。木蹄层孔菌适合在静置培养时产锰过氧化物酶，最适碳源和氮源分别为小麦麦麸和蛋白胨，酶在室温和偏酸性环境中耐受性较好，并对Mg2+有较好耐受性。

关键词：木蹄层孔菌;锰过氧化物酶;碳氮源;酶学性质

中图分类号： S182

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）15-0273-05

木质素是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大生物高分子材料，在能源和日用化工品应用方面具有巨大的潜在价值。锰过氧化物酶（MnP，E.C. 1.11.1.13）是一种含有血红素和Mn2+结合部位的过氧化物酶，它在木质素降解过程中发挥着重要的作用。MnP通过氧化Mn2+为Mn3+直接氧化木质素，并将Mn3+分泌到胞外。除了解聚天然和合成木质素，MnP还具有修复工业废料的巨大潜能，如降解难处理的工业污染物。MnP能够有效地进行合成染料的脱色，如甲基橙[1]和三苯甲烷类染料[2]，这种潜在的能力已经引起了广泛的关注。除了染料脱色，白腐真菌分泌的MnP还可以用于降解持久性有机污染物，如多环芳烃[3]、2，4，6-三硝基甲苯[4]和联苯中间代谢物[5]。如何提高白腐真菌MnP产量，提高酶的活性成为人们日益关心的问题。因此，产酶条件的优化和酶学特性的研究，将有助于MnP的产量增加，酶活力的提高，使MnP能够在未来更好地应用于各个领域。木蹄层孔菌（Fomes fomentarius）是担子菌门的一种白腐真菌，常见于桦树和杨树，广泛存在于非洲、亚洲、欧洲和北美洲，在我国主要分布于东北地区、西北地区和西南地区。前期研究发现，木蹄层孔菌能够有效降解白桦中的木质素，保留较高含量的纤维素和较低含量的1% NaOH和苯醇抽出物[6]，在白桦生物转化中具有潜在的应用价值。本研究进行了木蹄层孔菌产MnP的碳氮源优化及酶学性质研究，旨在为今后MnP的利用提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2013年9月至2014年3月在宁夏回族自治区北方民族大学进行。木蹄层孔菌为北方民族大学生物化学实验室保存，4 ℃生长于木屑麦麸培养基（78%白桦木屑、20%麦麸、1% CaSO4·H2O、1%蔗糖）。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（1 L）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、pH值自然。基础培养基[7]（1 L）：葡萄糖 10.0 g、酒石酸胺0.2 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO4 0.5 g、CaCl2 0.1 g、琥珀酸（二）甲酯 1.3 mL、微量元素70.0 mL、硫胺素（维生素B1）1.0 mg。其中微量元素1 L：MgSO4 3.0 g、MnSO4 0.5 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4 0.1 g、KAl（SO4）2·12H2O 10.0 mg、NaMoO4·2H2O 10.0 mg、次氮基三乙酸酯（NTA）1.5 g。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制备 将木蹄层孔菌接种到PDA固體培养基上，28 ℃避光培养约7 d待菌丝长满培养皿。取2个直径6 mm的菌饼接入装有15 mL液体培养基的三角瓶（100 mL）中，28 ℃避光静置培养。另取6个直径为6 mm的菌饼接入装有45 mL液体培养基的三角瓶（100 mL）中，28 ℃ 180 r/min 避光振荡培养。取液体培养基，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。

1.2.2 MnP活力测定 MnP酶活定义为1 min内催化氧化 1 μmol/L 愈创木酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）。酶活测定体系包括500 μL的粗酶液，300 μL的4 mmol/L的愈创木酚溶液，1 500 μL的酒石酸钠缓冲溶液（0.1 mol/L，pH值5），60 μL的10 mmol/L的MnSO4溶液，60 μL的5 mmol/L H2O2，580 μL的H2O。测定温度为30 ℃时，465 nm[ε=1.21×104 L/（mol·cm）]波长处2 min内吸光度的变化。

1.2.3 碳源和氮源的优化 试验采用单因素试验，考察不同碳源和氮源对木蹄层孔菌产MnP的影响。根据单因素试验结果，对最佳碳源和氮源进行2个因素4个水平正交试验，以获得碳源和氮源的最佳浓度。正交试验因素水平见表1。

1.2.4 酶反应的最适pH值和pH值耐受性 分别在温度 4 ℃，pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的缓冲液中测定粗酶液中MnP活力。同时，将粗酶液和pH值为3.0、3.5、4.0、45、5.0、5.5、6.0的缓冲液混合温度为在4 ℃保持1 h和 24 h，测定粗酶液中MnP活力。试验中的最高酶活定义为100%。

1.2.5 酶反应的最适温度和热耐受性 在最适pH值，温度为20、30、40、50、60、70、80 ℃条件下分别测定粗酶液中MnP活力。同时，分别在温度为20、30、40、50、60 ℃条件下将粗酶液保温1 h和24 h，测定粗酶液中MnP活力。试验中的最高酶活力定义为100%。

1.2.6 金属离子对酶反应的影响 在粗酶液中分别添加终浓度为1 mmol/L和10 mmol/L的钙（Ca2+）、铁（Fe2+）、镁（Mg2+）、铜（Cu2+）、钡（Ba2+）、锰（Mn2+）、锌（Zn2+）、钠（Na+）、钴（Co2+）、钾（K+）。最适pH值条件下，温度为 30 ℃ 保温1 h后测定粗酶液中MnP活力。试验中未添加金属离子的酶活定义为100%。

1.2.7 MnP的动力学研究 当愈创木酚浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mmol/L时，测定粗酶液中的MnP活力。

1.2.8 统计分析 本试验中所有数据均平行重复3次，结果为“平均值±标准差”。结果使用统计分析软件SPSS进行邓肯多重比较。

2 结果与分析

2.1 培养方式对木蹄层孔菌产MnP的影响

振荡培养和静置培养对木蹄层孔菌MnP活力的影响，结果见图1。将木蹄层孔菌在液体培养基中分别培养6、9、12 d后，静置培养产生的MnP活力均显著高于振荡培养。其中，静置培养9 d产生的MnP活力最大，达到89.16 U/L，相同条件下静置培养是振荡培养（21.04 U/L）的4.2倍。同时研究发现，静置培养9 d与静置培养12 d的酶活力差异不显著。

2.2 碳源和氮源的选择

2.2.1 不同碳源的选择 在培养基中分别添加10 g/L的可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、白桦木屑、麦麸作为碳源，研究不同碳源对木蹄层孔菌MnP活力的影响。试验结果见图2，以麦麸作为碳源时，在10、12、14 d产生的MnP活力均显著高于以玉米粉、白桦木屑作为碳源产生的酶活力。以麦麸作为碳源时，在12、14 d所产生的MnP活力无显著差异。以可溶性淀粉、麦芽糖作为碳源时，在整个培养期间，均未测得酶活。结果表明，以麦麸作为碳源，可以有效促进木蹄层孔菌MnP的产生，而可溶性淀粉和麦芽糖作为碳源不利于MnP的分泌。

2.2.2 不同氮源的选择 在培养基中添加10 g/L麦麸为碳源，分别添加0.2 g/L的酵母浸膏、酒石酸铵、牛肉膏、蛋白胨作为氮源，研究对木蹄层孔菌MnP活力的影响。试验结果见图3，4种不同的氮源处理所产MnP的活力，均在10～14 d内达到最大值，其中以蛋白胨作为氮源时，在10、12 d测得的MnP活力最高，均显著高于其他氮源测得的酶活。研究发现以蛋白胨为氮源时，10、12 d所产MnP活力并无显著差异。结果表明，蛋白质可以作为木蹄层孔菌产MnP的有效氮源，培养10 d即可获得理想的MnP产量，延长培养时间不利于MnP的有效积累。

2.3 碳源和氮源正交试验

基于上述碳源和氮源不同浓度的影响结果，设计2个因素4个水平正交表优化木蹄层孔菌产MnP的碳源和氮源浓度（表2）。正交试验结果显示，碳源对木蹄层孔菌MnP活力的影响最明显，氮源其次。本试验以培养10 d的MnP活力为主要指标，确定最佳MnP活力条件为麦麸23 g/L，蛋白胨 2 g/L。在此条件下MnP活力可达123.51 U/L，比优化前MnP活力提高了38.52%。

2.4 酶反應的最适pH值和pH耐受性

取静置培养10 d的粗酶液，以愈创木酚作为底物，在pH值3.5～6.0范围内，测定木蹄层孔菌MnP的最适pH值。结果显示，随着pH值的增加，MnP的活力逐渐增加，在pH值4.5时达到最大值，之后随着pH值的进一步升高，酶活力逐渐降低。其中，在pH值为4～5之间时，MnP均具有较高的酶活力，相对酶活均大于80%。在pH值4.5时MnP酶活力与pH值4和pH值5时相比差异显著，结果表明，木蹄层孔菌MnP的最适pH值为4.5（图4-A）。

在温度为4 ℃时，分别将粗酶液置于pH值为3～6的缓冲液中处理1 h和24 h，研究木蹄层孔菌pH值耐受性。结果显示，在pH值4.5和pH值5.0条件下分别处理 1 h 和24 h后，木蹄层孔菌MnP相对酶活力均能保持在89%以上，2种条件下测得的酶活力差异不显著。结果表明，木蹄层孔菌MnP在pH值4.5～5.0之间具有较好的耐受性（图4-B）。

2.5 酶反应的最适温度和温度耐受性

取粗酶液在温度为20～80 ℃条件下测定木蹄层孔菌MnP活力，研究其最适温度，结果见图5-A。随着温度的升高，MnP活力逐渐增加，当温度达到50 ℃时MnP活力达到最大，随着温度的进一步升高，MnP活力逐渐降低。其中，在温度为50、60 ℃条件下测得的MnP活力差异不显著，因此，确定木蹄层孔菌MnP的最适反应温度在50～60 ℃之间。

取粗酶液分别在温度为20～60 ℃条件下保温1 h和 24 h，研究木蹄层孔菌MnP的温度耐受性。结果见图5-B，当温度超过30 ℃时，粗酶液在保温1 h和24 h以后，酶活均开始降低。同一温度下MnP保温时间越长，酶活丧失越多。保温 1 h 时，温度为30、40 ℃的相对酶活几乎都保持在90%以上，并且2个温度的酶活变化差异不显著。保温24 h时，温度为20、30 ℃的酶活都保持在87%以上，但是温度超过 30 ℃ 时，酶活急剧丧失，当温度达40 ℃时，相对酶活只有63.92%。

2.6 金属离子对酶活力的影响

选取10种金属离子，研究1、10 mmol/L金属离子对木蹄层孔菌MnP活力的影响，结果见图6。当金属离子浓度为 1 mmol/L 时，与对照相比，粗酶液中添加Ba2+、K+、Ca2+、Co2+和Na+对木蹄层孔菌MnP活力具有显著抑制作用;而添加Zn2+、Cu2+和Fe2+对MnP活力无显著影响。当金属离子浓度为10 mmol/L时，除了Mg2+与对照无显著差异外，其他金属离子均表现出对MnP活力具有极显著的抑制作用，其中Mn2+和Co2+对酶活的抑制作用最大，相对酶活分别降低至20.92%和29.93%。在反应液中Mg2+浓度为1 mmol/L和10 mmol/L时，MnP相对酶活分别为93.76%和97.72%，表明Mg2+对MnP酶活几乎没有影响，差异不显著。

2.7 MnP的酶动力学研究

以愈创木酚作为底物的Lineweaver-Burk见图7，木蹄层孔菌MnP的米氏常数（Km）是0.34 mmol/L，最大速度（vmax）是0.12 mmol/（L·min）。Km值的大小一般能够体现酶对底物的亲和力大小。以愈创木酚作为底物，木蹄层孔菌MnP测得的Km较小，说明木蹄层孔菌MnP对愈创木酚亲和力较大。

3 讨论与结论

已有相关文献报道，白腐真菌产木质素酶的培养方式多选择振荡培养[8-9]，可能因为振动培养可以增加细胞和培养基之间氧的传递，同时增加生物量以及酶的产量。但是在木蹄层孔菌中发现，振荡培养测得的MnP酶活力远远低于静置

培养时，可能因为振荡培养会使木蹄层孔菌形成菌丝球，不利于分泌MnP，也可能振荡培养会使部分MnP因机械损伤失去活力。在对Pleurotus ostreatus的研究中也发现，其产生的木质素酶漆酶在静置培养时产量明显高于振荡培养[10]。

木蹄层孔菌MnP活力的最适pH值是4.5，在pH值 4.5～5.0之间时的耐受性最好，这与大多数研究报道的真菌[8，11-13]MnP相同，也介于4.0～5.5之间。木蹄层孔菌MnP的最适反应温度是50 ℃，温度为20～30 ℃时MnP的稳定性较好，在木质层孔菌和Echinodontium taxodii 2538中发现的MnP的最适温度分别为52、55 ℃[9]。

Mg2+（1、10 mmol/L）对木蹄层孔菌MnP活力没有影响，本结果与对木质层孔菌MnP酶的研究结果[13]相同。数据显示，1 mmol/L的Mn2+对木蹄层孔菌MnP活力没有显著影响，10 mmol/L Mn2+显著抑制MnP活力。尽管已有研究表明，金属离子Mn2+在很多白腐真菌中被认为是一种强有力的产酶诱导剂[14-15]，但是在木蹄层孔菌中却表现了对锰过氧化物酶产生抑制作用，具体原因还有待于进一步研究阐明。

本研究获得了木蹄层孔菌产MnP的最适培养方式为静止浅层培养，最佳碳源和氮源组合为小麦麸皮23 g/L、蛋白胨2 g/L。同时发现含木质纤维素的碳源有利于MnP的合成。木蹄层孔菌MnP的pH值耐受范围位于酸性区域，室温条件下稳定性较好，对Mg2+具有较好的耐受性。

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