脂肪因子ZAG在耐力运动改善大鼠胰岛素抵抗中的作用

韩雨梅 罗昕 冀里栋 田俊生 秦雪梅 李建英

摘 要：目的：研究肝臟ZAG在耐力运动改善高脂饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗中的作用机制。方法：雄性 Wistar大鼠32只随机分成安静对照组（N）、运动对照组（Ne）、IR安静组（IR）和IR运动组（IRe）。高脂饲料喂养建模（IR）5周，高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验验证模型成功。运动干预6周，转轮运动，20 m/min，45 min/天，5天/周。6周运动末禁食12 h后再次钳夹试验评价胰岛素抵抗状态，次日脱臼处死，全自动生化分析仪检测大鼠CHOL、HDL-CHOL、LDL-CHOL、TG水平，ELISA检测血清FINS，Western-blot检测肝脏ZAG和PGC-1a蛋白表达。结果：1）5周高脂饲料喂养成功诱导大鼠IR模型;2）IR组FINS、CHOL和TG显著高于N组，GIR显著低于N组，呈现IR的代谢特点;Ne组比N组大鼠体重极显著下降，FINS显著提高。IRe组比IR组大鼠体重、FINS均显著下降，GIR极显著性提高。3）IR组大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达均显著低于N组，Ne组和IRe组大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达均显著高于各自安静对照组。4）大鼠肝脏ZAG蛋白表达量与HDL-C、GIR、PGC-1α蛋白表达量显著正相关，与CHOL、TG、FINS显著负相关。结论：1）耐力运动可以提高IR大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达，改善血脂代谢，改善IR状态。2）耐力运动过程中大鼠肝脏ZAG可能通过促进线粒体生物合相关因子PGC-1α表达而发挥刺激脂肪分解的作用。

关键词：ZAG;PGC-1α;肝脏;胰岛素抵抗;耐力运动

中图分类号：G804.2 文献标识码：A文章编号：1006-2076（2019）04-0080-07

Abstract：Objective：To investigate the effects of liver Zinc-α2-glycoprotein （ZAG） on improving insulin resistance by endurance exercise in high-fat diet induced insulin resistant rats. Methods：32 male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：quiet control group （N），exercise control group （Ne），IR group （IR） and IR exercise group （IRe）. IR model group rats were fed with high-fat-diet for 5 weeks，and the insulin sensitivity was evaluated by improved high insulin-euglycaemic clamp test. The exercise program was that the rats were acclimatized to the motorized wheel running，20 m/min，45 min/day，five days per week，for a total of six weeks. After fasting 12 h in 6 weeks of exercise，the insulin resistance of all rats was evaluated by improved high insulin-euglycaemic clamp test again and then all rats were executed the next day. The serum lipid （CHOL，HDL-CHOL，LDL-CHOL，TG） levels were detected with the full-automatic biochemical analyzer. The serum fasting insulin level （FINS） was detected by using ELISA Kit，and the expression of ZAG and PGC-1α protein in liver was measured by Western-blot. Results：1） 5 weeks high-fat-diet successfully induced the IR of the rats; 2） IR group had higher FINS，CHOL and TG but lower GIR than N group，and presented the metabolic characteristics of IR. The Ne group had lower weight and higher FINS than N group，respectively. The IRe group had lower weight and FINS but higher GIR than IR group. The results revealed that endurance exercise significantly improved the rat IR; 3） Compared with N group，the expression of liver ZAG and PGC-1α protein in IR group was significantly reduced ，and the expression of ZAG and PGC-1a protein in the Ne and IRe groups were significantly higher than N and IR groups respectively. 4） ZAG protein expression in rat liver has shown significant positive correlation with HDL- C，GIR and PGC-1α protein expression，and shown significant negative correlation with CHOL，TG and FINS. Conclusion：1） Endurance exercise can increase the protein expression of ZAG and PGC-1α in liver of IR rats，ameliorate blood lipid metabolism and improve IR state.2） ZAG may stimulate adipose decomposition by promoting mitochondrial biogenesis factor PGC-1α protein expression in rat liver during the endurance exercise.

Key words：ZAG;PGC-1α;liver;insulin resistance;endurance exercise

胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）是指正常剂量的胰岛素产生低于其正常生物学效应的一种状态，主要表现为胰岛素作用的靶组织（骨骼肌、肝脏和脂肪）和靶器官对胰岛素敏感性及反应性降低[1]。研究证实，IR与心血管疾病、代谢综合征、肥胖、癌症和2型糖尿病等疾病的发生和发展密切相关[2]。肥胖可以通过诱导IR，增加2型糖尿病的风险。新近有学者提出，肥胖症中IR是细胞能量过剩的结果[3]。锌-α2-糖蛋白（Zinc-α2-glycoprotein，ZAG）是一种新型的脂肪因子，它在脂肪动员和利用方面发挥重要作用[4]，它可以通过特定的脂肪消耗诱导超重和肥胖动物体重减轻[5]，并有利于预防高脂饮食引起的肝脏脂代谢紊乱[6]，然而关于ZAG与IR的关系尚存在争议[7-9]。

有研究指出，脂肪组织中ZAG促进脂肪分解的作用可能是通过促进过氧化物酶体增殖激活受体（PPARγ） 辅激活子1 α（peroxisome proliferator-activated receptor- α （PPARγ） coactivator 1 α ，PGC-1a）等线粒体生物合成相关因子表达而刺激线粒体生物合成实现的[10]，人类前脂肪细胞ZAG基因沉默可导致PGC-1α mRNA表达下降[11]，然而肝脏中ZAG与PGC-1α的关系却知之甚少。

运动是改善IR的有效手段，也是国际上公认的控制肥胖最安全有效的途径[12]。运动对IR状态下ZAG影响的研究有限，多数集中在血清和脂肪组织，肝脏作为脂质代谢调节的重要器官，无疑在IR和运动过程中对机体脂肪代谢产生重要影响。本研究通过观察IR以及耐力运动对大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达的影响，探讨ZAG表达与IR及其脂代谢的关系，为运动干预IR相关疾病的治疗寻找新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验对象及IR建模分组

2月龄SPF级Wistar雄性大鼠32只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SCXK（京）2011—2012）。标准动物房饲养，室温24℃±1℃，湿度45%±15%，明/暗：12 h/12 h。常规分笼，自由进食和饮水，普通饲料喂养1周适应环境后，对照组喂食普通饲料（脂肪10%、蛋白质21%、碳水化合物69%），IR模型组喂食高脂饲料（脂肪59%、蛋白质20%、碳水化合物21%，购自北京华阜康生物科技股份有限公司），共饲养5周。

建模期5周结束后采用改良的高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验进行模型验证。建模成功后，将IR模型组大鼠和对照组大鼠分别随机分为安静对照组（N）、运动对照组（Ne）、IR安静对照组（IR）和IR运动组（IRe），IRe组与Ne组大鼠分别进行6周运动干预，运动干预期间IR和IRe组大鼠继续高脂饲料喂养。

1.2 高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验

高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术是目前国内外公认的评价胰岛素抵抗（IR）的金标准[13]，本研究中大鼠建模5周后禁食12 h，采用改良钳夹术对模型进行评价。大鼠固定，温水擦洗尾部，用50 U/mL肝素生理盐水冲洗留置针，将其刺入大鼠一侧尾静脉根部1/3处，随后连接微量注射泵（型号：RWD202瑞奥德）。另一侧尾静脉末1/3处取血检测BBG。开启注射泵的INS通道以0.12 U/（kg·h）的速度输入胰岛素，每隔10 min重复尾静脉取血测定血糖（GLU），GLU值超出BBG±0.5 mmol/L时，使用注射泵的第二通道注射27.5%的葡萄糖。根据大鼠GLU变化随时调节注射泵的平均葡萄糖輸送速率（glucose infusion rate，GIR），使GLU值稳定在（BBG±0.5）mmol/L水平。60 min后，GLU值连续3次稳定在既定水平时，提示大鼠血糖进入稳态，表明内源性胰岛素及葡萄糖调节被抑制，钳夹建立成功。记录大鼠60～120 min稳态时间段内葡萄糖输送速率（GIR），以此反映外周组织对胰岛素的敏感性，GIR越高，说明机体对胰岛素越敏感，反之，越不敏感。血糖变异系数 （CVGLU） 反映钳夹实验的准确性;GIR变异系数（CVGIR） 反映钳夹试验的可靠性。

变异系数 CV =（标准偏差 SD / 平均值Mean）×100%

1.3 运动干预方案

Ne组和IRe组大鼠适应性运动1周，第1～5天运动时间分别为20 min、25 min、30 min、35 min和45 min;此后采用Bedford跑台方案二级负荷[14]相同的转轮运动（大鼠转轮式跑步机型号：北京众实迪创YLS-15A）进行干预：20 m/min，45 min/天，5天/周，持续运动6周。

1.4 样品的收集与处理

大鼠6周转轮运动结束禁食12 h，采用改良的高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验再次检测大鼠GIR，用于评定IR，次日大鼠脱臼处死（禁食12 h），股动脉取血，静置30 min后，4℃，3 000 rpm离心15 min，留取血清检测生化指标。分离并留取大鼠肝脏组织，分装后迅速置于液氮，-80℃冰箱保存备用。

1.5 血液生化指标的测定

1）BBG采用便携式血糖仪（德国罗氏Accu-Chek）检测，血脂指标（CHOL、HDL-C、LDL-C、TG）委托太原市食品药品检验所检测。

2）空腹血清胰岛素（FINS）测定：采用碧云天生物技术有限公司ELISA检测试剂盒，严格按照说明书方法于酶标仪（BIO-RAD 680）上进行测定。

1.6 Western blot检测

每组准確称取100 mg肝脏组织，加入1 ml PIPA组织裂解液，10 μl PMSF，Twflon电动匀浆器匀浆后静止30 min，使其完全裂解。4℃ 12 000 rpm离心15 min，取上清液， BCA法测量样品蛋白浓度，调齐shagn2样量（50 μL/well）。使用碧云天SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，8%SDS聚丙乙烯酰胺凝胶电泳，4×Loading buffer混合SDS-PAGB蛋白上样缓冲液，95 ℃煮沸30 min使蛋白变性，蛋白上样到加样孔中，开始60 V稳压，30 min，然后120 V稳压，继续电泳90 min。电转恒流200 mA，2 h后可见Marker已完全转至PVDF膜上，然后用5 %脱脂奶粉进行封闭，37℃，2 h。洗膜后加入ZAG（Santa Cruz 公司，1∶300稀释）、PGC-1α（Santa Cruz 公司，1∶500稀释）和β-actin（Mrcgene 公司，1∶1 500稀释）一抗，4℃孵育过夜。次日用TBST液清洗3次，每次10 min。PVDF膜条带放入相应二抗（1∶2 500的比例稀释）中封口，温室摇床孵育90 min，洗涤3次，每次10min。加入一定量的超敏ECL化学发光液，均匀地覆盖到膜表面，冷却1至2分钟之后在Flour Chem凝胶成像系统中测定目的蛋白灰度值。灰度值（目的蛋白）/灰度值（β-actin 蛋白）等于目的蛋白相对含量。

1.7 数据的统计分析

采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，结果用平均数±标准差（[AKX-]±SD）表示，5周后建模数据采用t检验分析，其他数据进行双因素方差分析（General Linear Models-Multivariate），P<0.05 表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

2 实验结果

2.1 5周高脂饲料喂养后高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验结果

如表1所示， IR模型组比对照组大鼠体重和基础血糖值显著提高，说明大鼠具有肥胖和2型糖尿病发展倾向，但由于基础血糖值<16.7mmol/L，说明IR模型组大鼠尚未达到2型糖尿病标准[15];同时IR模型组GIR值极显著低于N组，说明外周组织葡萄糖利用率下降，表明胰岛素抵抗模型诱导成功;两组大鼠的CVGLU和CVGIR均小于15%，表明本次钳夹试验准确可靠。

2.2 耐力运动后各组大鼠IR相关指标的变化

如表2所示，IR组与N组相比，血清FINS极显著升高，GIR极显著下降，呈现出了IR的代谢特点;Ne组与N组相比，大鼠体重显著性下降，FINS显著增加。IRe组比IR组大鼠体重、FINS均显著下降，GIR极显著性提高。

2.3 耐力运动后各组大鼠血脂四项指标的变化

由图2可见，与N组相比，IR组与大鼠CHOL和TG均显著升高;Ne组各指标没有显著改变。IRe组比IR组大鼠CHOL和TG均极显著下降。

2.4 耐力运动后各组大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达量变化

由图3、图4可见，与N组相比，IR组大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达均显著降低，6周耐力运动后Ne组和IRe组肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达均显著高于各自安静对照组。

2.5 大鼠肝脏ZAG蛋白表达与血脂四项及肝脏PGC-1α蛋白表达的相关性

如表3所示，大鼠肝脏ZAG蛋白表达分别与HDL-CHOL水平、PGC-1α蛋白表达、GIR显著正相关，与CHOL、TG和FINS 显著负相关，与LDL-CHOL无统计学意义。

3 分析与讨论

3.1 IR大鼠模型的建立及其评价

高脂饮食诱导的IR模型具有糖耐量受损和2型糖尿病早期的稳定特性[16]，高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验是国际上公认的评价IR的金标准[17]。本研究中大鼠经过5周高脂喂养后IR模型组比对照组GIR值极显著性降低，提示外周组织葡萄糖利用率下降，IR模型诱导成功;同时IR组体重、BBG显著增加，说明IR模型组存在肥胖、糖尿病发展倾向;但IR模型组体重未超出对照组体重20%，且BBG<16.7mmol/L[15]，说明IR模型组大鼠尚未达到2型糖尿病状态。

3.2 耐力运动对IR大鼠生理生化指标的影响

研究表明，脂代谢紊乱是IR常见表现，它既是IR 的重要组成要素，也是导致冠心病等的主要危险因素。在非脂肪组织中，过度的TG积累会对细胞产生毒性作用，并降低对胰岛素的敏感性，最终导致糖尿病和代谢综合症[18]，高TG是血脂异常的显著特征之一[19]，高CHOL似乎与IR没有直接相关性[20]，可能与肠道菌群的缺失有关[21]。本研究中IR组大鼠呈现出了IR的特征，FINS、TG和CHOL显著增加，GIR显著降低。耐力运动后上述指标均得到了有效逆转，血脂代谢改善，与多数文献报道一致[22-23]，整体来看，耐力运动对IRe组干预效果比Ne组更加明显。

3.3 耐力运动对IR大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达的影响

ZAG是首先在人类血浆中分离出来的一种新型脂肪因子，分子量 43KDa，其名称来源于其沉淀锌盐的倾向和在 α2-球蛋白区域的电泳迁移率[24]。近年来研究证实，ZAG具有强烈促进脂肪分解，减少脂肪积聚的重要作用[4]。ZAG广泛表达于脂肪组织、肝脏、胃肠道、前列腺等，并可以分泌到血清和其他体液中[25]。最初认为ZAG 作为脂质动员因子在癌症病人恶病质中发挥促进脂解的重要作用，目前发现ZAG并非癌症特异性的脂解调节器，健康人体在热量限制后脂肪组织ZAG也会分泌增加，是一种普通的脂质分解代谢标志物[26]。ZAG与IR的关系目前尚存争议，有研究发现，肥胖患者血清、脂肪组织和肝脏ZAG表达均显著下降，然而与IR无相关关系[9]。另有研究显示，ZAG指数比其他指标更能有效预测IR[7]。此外，肥胖者皮下脂肪而非内脏脂肪中ZAG含量显著下降，临床和细胞分子证据显示ZAG在调节全身及皮下脂肪组织胰岛素敏感性中发挥重要作用[11]。本研究观察到IR组大鼠肝脏ZAG蛋白表达较N组显著下降，且大鼠肝脏ZAG含量与GIR、HDL-C显著正相关，与FINS、CHOL、TG显著负相关，提示大鼠肝脏ZAG蛋白表达与IR密切相关。

研究發现，人类原代脂肪细胞中ZAG基因沉默可以导致脂联素、胰岛素受体底物1（IRS1）、葡萄糖转运蛋白4 （GLUT4）和线粒体生物合成转录因子PGC-1α mRNA表达下降，表明ZAG与线粒体生物合成有关[11]，可能通过刺激线粒体生物合成，增加组织的脂质氧化作用从而起到促进脂肪分解的作用。脂肪分解是甘油三酯最终转化成乙辅酶 A的过程， 线粒体脂肪酸 β 氧化是脂肪分解利用的关键步骤。肥胖相关疾病发生早期，脂肪酸β氧化减少与线粒体功能受损有关，会导致细胞内游离脂肪酸增加。细胞持久而过量的脂质蓄积，将导致细胞氧化磷酸化和ATP合成酶功能低下，加重氧化损伤和线粒体DNA衰竭，导致脂肪细胞线粒体功能失调[27]。研究表明，线粒体功能障碍与胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖等发病密切相关[1，28]。研究人员将ZAG质粒稳定转染到3T3-L1（前脂肪）细胞中，发现ZAG对线粒体生物合成相关因子PGC-1α 、NRF-1/2、mtTFA mRNA表达有促进作用，并进一步证实这种作用通过PKA和p38MAPK信号通路介导[27]。Xiao等研究表明，肝脏ZAG过度表达明显抑制了脂肪的生成，促进了脂肪分解和脂肪酸β氧化，减少了细胞内脂肪的积累;ZAG敲除则显著抑制了脂肪酸β氧化，增加脂肪生成和脂质积累，表明ZAG有减轻脂肪肝的积极作用，是脂肪肝治疗的一个很有前景的目标靶向[25]。本研究中IR组大鼠肝脏PGC-1α 蛋白表达显著低于N组，并且与ZAG 蛋白表达显著正相关，可能是导致IR组大鼠肝脏脂肪分解能力下降，输出TG增多，导致血液TG和CHOL异常升高 的机制之一。血液中高水平TC可以与葡萄糖竞争进入细胞，影响葡萄糖的利用和代谢，还会抑制胰岛素与其受体结合，导致血中胰岛素水平升高[29]。

运动锻炼能够引起机体一系列的代谢适应，并且是预防和治疗IR的有力工具[30]，然而关于运动与ZAG关系的研究文献相对较少。刘琼等认为，运动可能通过兴奋交感神经，作用于 β3-肾上腺素受体来促进肝脏 ZAG mRNA 表达水平的增加，进而影响脂代谢[12]。也有研究指出，肥胖者锻炼6个月后腹部脂肪ZAG mRNA表达无显著改变[31]。PGC-1α是一种多功能辅助活化因子，是代谢适应的重要调节剂，它可以诱导线粒体生物合成以及适应性产热，也与糖尿病、运动过程中的能量代谢、肥胖等密切相关[32-33]。 耐力运动可以促进饮食诱导的肥胖小鼠肝脏PGC-1α的表达增加，提高胰岛素的积极作用[34-35]，然而PGC-1α与ZAG关系尚不明确。本研究发现耐力运动均可诱导IR大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达显著增加，且二者显著正相关，结合前人研究结果，可以推测耐力运动过程中大鼠肝脏ZAG可能通过促进线粒体生物合相关因子PGC-1α表达而发挥刺激脂肪分解的作用。

ZAG表达受多种因子调节，如PPARγ和糖皮质激素、肿瘤坏死因子-α、脂联素和瘦素等[12]。除了脂肪动员和分解作用外[5]，ZAG还具有促进精子能动性、充当载体蛋白、参与免疫调节与抑制、细胞粘附、核糖核酸酶活性、调节黑色素产生和阻碍肿瘤扩散等诸多作用[36]。最新证据表明，ZAG还可能参与了心衰、炎症反应、血液透析相关的心血管疾病以及肌萎缩的病理机制[37-40]。目前 ZAG与IR的相关研究文献有限，ZAG改善IR的具体分子机制还未完全阐明。总之，ZAG作为新近鉴定的脂肪动员因子，其在促进脂肪动员分解代谢、调节胰岛素分泌方面发挥重要作用，以ZAG为干预靶向无疑将为运动干预脂代谢异常相关疾病，如IR及糖尿病等疾病的防治带来积极的益处。

4 结论

4.1 耐力运动能够提高IR大鼠肝脏ZAG和PGC-1α蛋白表达，改善血脂代谢，改善IR状态。

4.2 耐力运动中大鼠肝脏ZAG可能通过促进线粒体生物合相关因子PGC-1α表达而发挥刺激脂肪分解的作用。

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