虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸与C/N相关性研究

谢 玺 王庆志 滕炜鸣 刘项峰 于佐安 李华琳 周遵春

(辽宁省海洋水产科学研究院, 大连市海产贝类种质资源创新利用重点实验室, 大连 116023)

扇贝(Pectinidae)是海产双壳类软体动物扇贝属的泛称, 是世界各国重要的渔业资源, 在海洋生态系统的功能服务和动物进化适应机制的研究中占有重要地位[1,2]。作为典型的单柱型瓣鳃类, 扇贝闭壳肌硕大发达, 含有丰富的脂肪、氨基酸、微量元素等营养物质, 为国内外消费者所喜爱的海产珍品[3,4]。虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)自然分布于日本北海道和本州北部、朝鲜半岛以及俄罗斯远东海域, 并向北延伸至库页岛与鄂霍次克海[3],其个体大而生长快, 是适于发展扇贝增养殖业的优良品种, 目前已经成为我国北方扇贝增养殖的主导品种, 在黄海北部形成了产业优势, 其增养殖面积发展到7000余km2, 年平均产量近3×108kg, 创造产值高达数百亿元, 取得了显著的社会经济效益[4—6]。

近年来, 由于虾夷扇贝在我国主产区死亡率居高不下, 高温期养成贝的成活率低, 造成了扇贝收成大规模减产, 制约了产业的健康稳定发展。研究表明种质衰退、环境变化、病原侵袭等均可能与虾夷扇贝的大规模死亡有关[7—10], 培育高产、优质、抗逆新品种, 实现贝类养殖良种化, 是保障贝类产业可持续发展的一种有效途径[11,12]。当前虾夷扇贝良种覆盖率低, 养殖所用苗种的生长、抗逆性乃至品质质量等性状大多未经系统的定向选育。选择育种是以现有品种个体间的自然变异作为选择的原始材料, 通过逐代定向选择, 使得目标性状不断累积直至形成新品种的传统有效方法, 也是世界主要养殖国家研究最早、使用最广泛的技术之一, 特别是近年来分子遗传标记的辅助使用和多性状复合评价方法的引入, 使得选择育种技术更趋完善[13—15]。我国重要经济扇贝的良种选育工作现阶段已取得相当进展, 成功选育出“中科红”海湾扇贝(Argopecten irradians)、“蓬莱红”栉孔扇贝(Chlamys farreri)和“海大金贝”虾夷扇贝等新品种,促进了扇贝养殖业的健康发展。随着消费者对食物与健康相关性认知的日益增加, 水产品的营养品质和安全已成为水产养殖业关注的重要因素, 但目前扇贝的人工选育还主要集中在生长、壳色等方面, 有关优质高抗的新品种选育研究报道较少[16]。

脂肪酸根据碳氢链的不饱和程度分为饱和脂肪酸(Saturated fatty acids, SFA)、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acids, MUFA)以及多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFA)。不饱和脂肪酸在营养学上常依据第一个双键出现的位置分为n-3、n-6、n-9族等。必需脂肪酸全部是n-3和n-6族PUFA, 为人体健康和生命所必需, 但由于缺乏相应的去饱和酶, 机体不能自身合成, 需要从外界摄取。随着植物性油脂在餐饮业的大量应用, 人们在日常饮食中往往摄入过量的n-6族PUFA。研究表明, n-3和n-6族PUFA都是合成类二十烷酸化合物的前体, 二者的平衡摄入能够调节机体免疫和基因表达[17], 降低心血管疾病或中风的发作风险, 对冠心病患者的细胞端粒有保护作用[18,19], 还能通过酶促反应转变为具抗炎作用的内源性大麻素, 在机体免疫系统正常运行前提下抑制炎症反应[20]。因此, 适量补充n-3族PUFA显得尤为必要[21]。2014年召开的国际营养学会议(SICN)提出, 鱼类和其它海产品是人类蛋白质和必需微量营养素的重要膳食来源, 并强调海产品特有的n-3族长链脂肪酸二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)是保障育龄妇女及婴幼儿生长发育的必需脂肪酸[22]。

由于后生动物的C元素更多地用于形成脂质或者碳水化合物, N元素是构成蛋白质的重要元素, 因此化学元素C和N既是维持生命新陈代谢活动的结构基础, 又是贮存能量的载体, 与生物的生长、发育、繁殖和代谢等生理行为密切相关[23]。本研究在前期虾夷扇贝优质新品种选育工作基础上[16], 分析了不同生长性状的虾夷扇贝家系闭壳肌C、N元素含量, 比较了不同家系间闭壳肌脂肪酸组成与含量差异, 阐明了闭壳肌元素C/N比值与脂肪酸含量的相关性, 研究结果为开展虾夷扇贝闭壳肌高品质营养素良种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 家系构建

虾夷扇贝家系建立于2015年4月, 从大连长海县人工底播增殖群体中, 随机选取3—4龄、性腺发育成熟且性状优良的个体为亲本, 参考王庆志等[16]的方法, 采用巢式交配设计获得了35个全同胞家系。在辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心完成扇贝幼虫和稚贝培育, 在大连长海县海域进行浮筏养成。

1.2 生长性状测量

2016年10月, 在自然海区水温为15—16℃, 扇贝平均壳长生长至5—6 cm时, 根据壳长随机选取3小(32#、87#、93#)3大(25#、54#、19#)共6个家系, 每个家系含30—50枚健康活泼扇贝, 冷藏运回辽宁省海洋水产科学研究院海水养殖实验室。各家系用游标卡尺(精度为0.01 mm)测量30枚壳长、壳宽及壳高, 以电子天平(精度为0.01 g)称量扇贝湿重; 并剖取软体部于60℃烘干至恒重, 以分析天平(精度为0.0001 g)分别称量闭壳肌与软体部干重, 计算出柱率(出柱率=闭壳肌干重/软体部干重)。每个家系闭壳肌(干样)通过完全随机区组平均分成三个生物学重复, 以研磨机(IKA-A11)粉碎, 仔细研磨,反复过筛(80目), 干燥保存, 以备脂肪酸含量和元素分析测定所用。

1.3 脂肪酸含量分析

虾夷扇贝闭壳肌的脂肪酸组成及含量采取一步转酯化法测定[24,25]。用分析天平(精度为0.01 mg,MSE125P-1CE-DI, Sartorius, Germany)称取约100 mg样品, 移入10 mL圆底烧瓶中, 先以微量进样针加入内标十九烷酸甲酯(加入量为样品脂质含量的1/10,Sigma, USA), 再加入5 mL 2% H2SO4-甲醇, 70℃油浴反应1h制备脂肪酸甲酯, 冷却回流10min后, 加入2 mL正己烷(色谱纯, Merck, Germany)和0.75 mL双蒸水, 磁力搅拌1min, 转至加有无水硫酸钠的离心管中, 静置分层, 吸取上层萃取液(含脂肪酸甲酯的正己烷)至2 mL色谱瓶中进行气相色谱(Agilent 7890A, USA)分析。设置进样量为1 μL, 检测器为FID(氢火焰离子化检测器), 载气为高纯氮气, 前进样口及前检测器温度均为270℃, 分流比为10:1, 色谱柱为DB23(30 m×320 μm×0.25 μm, Agilent,USA), 升温程序： 初始值为130℃, 以10℃/min的升温速率升至170℃, 再以2.5℃/min的升温速率升至210℃, 保持2min。每种脂肪酸的相对丰度与质量含量的计算公式分别为：

式中,Pi为每种脂肪酸的相对丰度, 即每种脂肪酸含量占总脂肪酸含量的百分比;Mi为每种脂肪酸的绝对含量, 即每克扇贝样品所含有每种脂肪酸的毫克数,Ai为每种脂肪酸的峰面积, ΣAi为所有脂肪酸的峰面积之和,As为内标十九烷酸甲酯的峰面积,Ms为内标十九烷酸甲酯的加入质量(mg),Ma为扇贝样品的质量(g)。

1.4 元素分析

采用元素分析仪(EURO EA 3000)的CHN模式测定扇贝闭壳肌C、N元素的百分含量, 测定前用超微量自动分析天平(精度为0.001 mg, Mettler Toledo XP6)精确称量0.5—1.0 mg样品置于锡舟中,用镊子严密包裹成大小适宜的颗粒, 放入自动进样盘中, 前燃烧炉温度为1020℃, 后燃烧炉温度为920℃, 样品测定时间为320s, 高纯氦气的压力是0.30—0.40 MPa, 高纯氧气的压力是0.20—0.22 MPa,氧气流量为80 mL/min, 灼烧时间为8.7s。

1.5 数据分析

2 结果

2.1 生长性状

实验选取的6个家系(32#、87#、93#、25#、54#和19#)的虾夷扇贝壳长、壳高、湿重与闭壳肌干重等生长性状如图 1所示。从生长性状上分析,生长较慢的家系与生长较快的家系差异显著(P＜0.05,n=30); 其中家系32#、87#和93#生长较慢, 其扇贝壳长(42.38—44.21 cm)、壳高(44.03—44.67 cm)、湿重(8.70—10.45 g)、闭壳肌干重(0.35—0.44 g)差异不显著(P＞0.05,n=30); 而家系25#、54#和19#生长较快, 其壳长(56.30—58.87 cm)、壳高(57.29—60.09 cm)、湿重(18.23—20.64 g)、闭壳肌干重(0.78—0.95 g)间的差异同样不显著(P＞0.05,n=30)。

2.2 脂肪酸组成与含量

虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸组成相同, 具有较长的C链(C14—C22)与多不饱和脂肪酸, 共检出23种脂肪酸, 包括C14:0、C15:0、C16:0、C17:0、C18:0等5种饱和脂肪酸(SFA), C16:1n7、C17:1n7、C18:1n7、C18:1n9、C20:1n7、C20:1n9、C20:1n15等7种单不饱和脂肪酸(MUFA), 以及C16:4n3、C18:2n6、C18:3n3、C18:4n3、C20:2n6、C20:4n6、C20:4n3、C20:5n3(EPA)、C22:3n6、C22:5n3、C22:6n3(DHA)等11种多不饱和脂肪酸(PUFA); PUFA相对丰度为58.58%—60.30%,SFA为28.16%—30.06%, MUFA为11.35%—11.68%,其组成特点为PUFA＞SFA＞MUFA (表 1)。其中, MUFA(1.61—1.76 mg/g)含量最低; SFA (4.06—4.55 mg/g)以C16:0 (2.46—2.75 mg/g)为主, C18:0 (1.09—1.23 m/g)次之; PUFA (8.11—9.16 mg/g)含量较高, 主要是EPA (3.59—4.09 mg/g)和DHA (3.03—3.46 mg/g),二者合计占各家系扇贝闭壳肌脂肪酸总量的47.19%—49.32% (表 2)。

图 1 虾夷扇贝家系生长性状Fig. 1 The growth performance in distinct families of M. yessoensis

方差分析表明, 抽样家系虾夷扇贝闭壳肌脂肪酸的相对丰度有一定差异(表 1), 而脂肪酸的质量含量差异较小(表 2); 除了家系32#和家系19#在SFA的含量上差异显著外(P＜0.05,n=3), 其余各家系在脂肪酸总量(TFA)、PUFA、EPA、DHA等主要脂肪酸含量上无显著差异(P＞0.05,n=3), 但变化趋势较为明显, 即生长较快的家系(25#、54#、19#)其脂肪酸含量较低, 其中家系19#的闭壳肌的TFA、SFA、PUFA、n-3系PUFA、EPA、DHA含量均最低(图 2)。通过n-MDS和Cluster分析可知,虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸相似度明显分聚成3组,其中家系32#独自分出(图 3a)且相距最远(图 3b),表明其闭壳肌脂肪酸相对丰度与其他家系差异最大, 随即家系87#和93#分布在一起(图 3a), 而生长较快的3个家系25#、54#和19#也被聚为一组(图 3a),特别是家系25#和54#距离最近(图 3b), 说明两家系脂肪酸组成最为相似。

2.3 元素分析

不同虾夷扇贝家系闭壳肌的C、N元素组成以及C/N元素比值呈现不同特点(图 4)。首先, 虾夷扇贝闭壳肌C元素的含量(38.45%—40.04%)变化规律不明显, 其中家系32#含量最低(38.45%), 家系25#含量最高(40.04%), 二者差异显著(P＜0.05,n=3), 其余家系差异不显著(图 4a); 其次, 扇贝闭壳肌N元素含量(9.99%—11.02%)总体呈现家系生长愈快含量愈低的变化趋势, 其中家系19#含量最低(9.99%), 与家系54#差异不显著(P＞0.05,n=3), 显著低于家系32#、87#、93#和25#(图 4b); 而与N元素含量变化相反, 家系扇贝闭壳肌C/N比值(3.57—3.94)整体表现为家系生长越快比值越高, 其中家系19#的C/N比值为3.94, 显著高于其他家系(图 4c)。

表 1 虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸组成Tab. 1 The fatty acid compositions (%) of adductor muscle in distinct families of M. yessoensis

表 2 虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸质量含量Tab. 2 The fatty acid content (mg/g) of adductor muscle in distinct families of M. yessoensis (mg/g)

图 2 虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸质量含量Fig. 2 The fatty acid content of adductor muscle in distinct families of M. yessoensis

2.4 相关性分析

虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸含量与C/N比值相关关系如图 5所示, 不同家系闭壳肌总脂肪酸TFA含量、饱和脂肪酸SFA含量、多不饱和脂肪酸PUFA含量、n-3系脂肪酸含量、EPA以及DHA均与闭壳肌元素C/N比值呈显著负相关。其中, 扇贝闭壳肌DHA含量与元素C/N比值相关性最强(相关系数为-0.726), 其余主要脂肪酸含量与C/N元素比值具有中等程度相关性(相关系数为-0.690— -0.539,表 3)。

3 讨论

3.1 闭壳肌是扇贝选育的重要性状

家系选育是水产动物选择育种的重要手段, 被广泛应用于水产养殖生物的种质改良[27], 有关虾夷扇贝的人工选育已有一些研究。张存善等[11]通过对33个全同胞家系的壳长、壳高、壳宽和活体质量的生长进行动态跟踪, 发现不同家系间的生长性状差异极显著, 分别有壳高与湿重生长快速的家系。本实验以虾夷扇贝壳长、壳高、湿重、闭壳肌干重等主要生长性状为筛选指标, 对全同胞家系进行抽样分析时发现, 家系25#、54#和19#在壳长、壳高、湿重、闭壳肌干重方面优于家系32#、87#和93#, 表现出了显著的生长优势, 说明家系25#、54#和19#的生长速度相对较快, 而家系32#、87#和93#的相对生长较慢。Liang等[28]利用歧化选择法构建了虾夷扇贝壳高的上选家系和下选家系,通过一代选育即可使壳高生长速度提高7.85%。丁君等[29]对选育的“象牙白”品系(双壳白色)与普通群体虾夷扇贝的营养成分进行了比较分析, 发现在一些重要营养成分上“象牙白”扇贝已表现出分化。王庆志等[16]以存活率为考察指标开展了虾夷扇贝的耐高温品系选育与早期筛查工作, 发现不同家系的耐高温性差异显著且受遗传因素影响较大, 家系的生长与存活没有明显相关性。相较于集中在生长、壳色、存活率等性状的扇贝良种选育工作, 对扇贝可食部位闭壳肌的营养品质进行育种研究的报道较少。闭壳肌既是扇贝主要可食用部分, 也是其重要的经济性状, 其营养价值和闭壳肌质量可作为家系选育的重要目标性状[30,31]。

3.2 闭壳肌脂肪酸在扇贝选育中的意义

脂肪酸是脂类的主要组分, 能够为所有营养水平的代谢提供能量, 也常常作为细胞间的信号物质,在生命体中发挥着重要作用[32]。美国膳食指南推荐, 5%至10%的能量应当从多不饱和脂肪酸中获取[33]。水产品所特有的n-3多元不饱和脂肪酸已被证明对人类具有很好的疾病预防与保健效应, 其中EPA和DHA能够参与调节人体心血管系统、神经系统和免疫系统, 并且具有健脑明目、提高记忆力、增强免疫力、抗炎症抗癌和预防心血管疾病等功效[34,35]。据营养学研究发现, 人体自身不能合成这类必需脂肪酸, 只能从食物中摄取, 所以食物中的含量越多营养价值越高; 人类饮食中的n-3/n-6比例过去一直维持在1/2, 现代健康膳食结构推荐该比例应为1/4-1/6, 而当前的生活环境和饮食习惯已使大多数人n-3/n-6脂肪酸摄入失调达到1/10;研究表明这样的变化易导致肥胖和患炎症类疾病的风险升高[17,36]。因此, 开展高品质脂肪酸闭壳肌虾夷扇贝的良种选育工作, 有利于丰富人们膳食结构, 促进高附加值海洋功能保健品的开发。近年来不断有报道研究水产动物家系间的肌肉营养成分差异, 以期通过选择育种对肌肉品质进行遗传改良,并把脂肪酸作为人工选育的重要指标之一。张永珍等[37]对半滑舌鳎不同家系肌肉中脂肪酸的组成与含量进行了比较, 发现15个家系的DHA和EPA含量具有显著性差异, 并筛选出3个高EPA+DHA含量的家系。李明云等[38]测定了四个家系大黄鱼肌肉中脂肪酸含量, 发现不同家系间PUFA、EPA、DHA的含量存在差异。本研究中不同虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸组成相同, 具有较长的C链(C14-C22)与多不饱和脂肪酸, 其含量特点为PUFA＞SFA＞MUFA, EPA (3.59—4.09 mg/g)和DHA(3.03—3.46 mg/g)之和占比扇贝闭壳肌脂肪酸总量的47.19%—49.32%。综合分析发现, 虽然不同家系虾夷扇贝闭壳肌TFA、PUFA、EPA、DHA等脂肪酸含量上差异较小, 但生长速度快的家系(25#、54#、19#)与生长速度慢的家系(32#、87#和93#)相比其脂肪酸含量较低, 且其脂肪酸的相对丰度差异明显, 表明在进行虾夷扇贝生长相关选择育种时结合闭壳肌脂肪酸组成与含量开展复合性状选育是可行的。此外, 本实验选取的6个家系是在相同的养殖环境下摄食、生长与发育的结果, 分析时采用混合样品(每个家系取30枚扇贝样品混合测定)基本排除了个体间差异。因此, 家系间脂肪酸组成的差异可能主要受遗传因素影响, 这与不同家系大黄鱼肌肉脂肪酸的研究结果相近[38,39]。本研究中家系间脂肪酸组成差异总体不大可能与取样家系数量较少有关, 进一步开展相关选育时应构建较多数量的家系。

图 3 虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸相似度分析Fig. 3 The similarity analysis of fatty acids of adductor muscle in distinct families of M. yessoensis

图 4 虾夷扇贝家系闭壳肌元素C、N含量与C/N比值Fig. 4 The carbon content, the nitrogen content and C/N ratio of adductor muscle in distinct families of M. yessoensis

3.3 扇贝家系闭壳肌碳氮元素与脂肪酸含量的相关性

细胞是构成生物体的基本结构和功能单位, 组成细胞的生物大分子和细胞器是生物体吸收和储存元素的表现形式, 而特定的元素组成是生物体维持其正常生命活动的必要保证。因此, 生物的生长过程实质上是对元素(如C、N、P等)进行积累以及相对比率进行调节的过程[40]。本文探究了不同家系虾夷扇贝闭壳肌C、N元素含量及其比率特征,发现虾夷扇贝家系闭壳肌C元素和N元素含量分别为(39.21±0.04)%和(10.62±0.16)%, 在黄海基础食物网中处于鱼类肌肉的C、N元素含量[(47.8±2.48)%和(13.5±1.15)%]与浮游动物C、N元素含量[(23.4±8.04)%和(6.19±1.91)%]之间, 但扇贝闭壳肌C/N比值(3.70±0.06)均低于鱼类肌肉(4.16)与浮游动物(4.37)[41]。由于后生动物的C元素更多地用于形成脂肪或者糖类, N元素是构成蛋白质的重要元素, 因此本研究C/N元素比值主要反映了虾夷扇贝闭壳肌中脂质或糖与蛋白质的相对含量。虽然不同家系的虾夷扇贝闭壳肌C、N元素稳态性较好, 但其C/N比值总体变化趋势与N元素含量呈反比, 且表现为闭壳肌越重比值越高, 说明扇贝家系闭壳肌元素C/N比值与闭壳肌生长趋势变化一致。此外, 闭壳肌元素C/N比值还与扇贝家系闭壳肌的TFA含量、SFA含量、PUFA含量、n-3系脂肪酸含量、EPA以及DHA含量分别呈显著负相关性, 其中与闭壳肌DHA含量的相关性最强, 其余均呈中等程度相关性。这表明生长较快的虾夷扇贝家系, 其闭壳肌主要营养物质的积累除了大量脂质和蛋白质以外,与生长较慢的家系闭壳肌相比可能富含更多的碳水化合物, 不过相关推论有待于进一步研究验证解析。

图 5 虾夷扇贝闭壳肌脂肪酸含量与元素C/N比的线性相关拟合方程Fig. 5 Linear fits between the fatty acid content and C/N ratio of adductor muscle in M. yessoensis

表 3 虾夷扇贝闭壳肌脂肪酸含量与元素C/N比值的Pearson检验Tab. 3 Pearson tests between the fatty acid content and C/N ratio of adductor muscle in M. yessoensis

4 结论

家系选育是水产动物选择育种的重要手段, 双壳贝类中成功开展家系选育的报道不多, 根据闭壳肌营养价值进行家系选育的研究更少。本文在前期虾夷扇贝优质新品种选育工作基础上, 以一龄虾夷扇贝的生长性状、闭壳肌脂肪酸组成与含量、闭壳肌C、N元素含量及其比值为主要考察指标,通过对比选育家系的生长性状, 分析了不同生长速度的虾夷扇贝家系闭壳肌脂肪酸组成与含量差异,研究了闭壳肌C、N元素含量及其C/N比值与脂肪酸含量的相关性。研究结果表明, 不同家系虾夷扇贝闭壳肌主要脂肪酸含量上差异较小而相对丰度差异明显, 同时不同家系的虾夷扇贝闭壳肌C、N元素稳态性较好, 且闭壳肌元素C/N比值与闭壳肌生长趋势变化一致, 而与DHA等闭壳肌主要脂肪酸含量呈负相关性。因此, 在进行虾夷扇贝生长相关选择育种时, 可以结合闭壳肌脂肪酸组成与含量、闭壳肌C/N元素比值开展复合性状选育。