DcR3表达在肝癌细胞凋亡和增殖中的作用研究*

彭 亮，赵静静，娄晓丽，侯彦强

(南京医科大学上海松江临床医学院，上海 201600)

肝癌是世界上最常见的内脏肿瘤之一，在全世界所有肿瘤病死率中居于第3位，其发生的分子机制主要包括癌基因和抑癌基因的突变、生长因子的失控表达、HBV/HCV 病毒蛋白对肿瘤信号通路的激活和调控等[1]。诱骗受体3(DcR3)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的新成员，能够竞争性结合死亡配体 FasL、LIGHT 和 TL1A，阻断相关信号转导通路，调节细胞增殖，抑制细胞凋亡[2]。有研究发现，肝癌组织中 DcR3 的表达远远大于其癌旁组织和健康组织，提示 DcR3 可能作为癌基因在肝癌的发生、发展中起重要作用[3]。本研究通过体外试验探讨 DcR3 对肝癌凋亡和增殖的影响，为肝癌细胞分子治疗靶点的筛选和预后判断提供理论基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 人肝癌细胞株 HepG2、MHCC-LM3 和 MHCCC-97H 均购自北京中科质检生物技术有限公司；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；目的质粒(LV-DcR3)和空载质粒(LV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES)均购自上海吉凯基因化学技术有限公司；鼠抗DcR3单克隆抗体(美国Abcam公司)，鼠抗 GADPH 单克隆抗体(武汉艾美捷科技有限公司，中国)辣根过氧化物酶 HRP 标记亲和纯化山羊抗小鼠 IgG 二抗(美国sigma公司)；逆转录试剂盒，荧光定量 PCR(qPCR) 试剂盒均购自日本 Takara公司，PCR 引物序列 (上海生工生物工程有限公司，中国 )，DcR3引物序列：上游引物 为5′- CCA CTA CAC GCA GTT CTG GA-3′，下游引物为5′-GTG CTC CAA GCA GAA ACC AG-3′,β-actin引物序列：上游引物为 5′-CCT GGC ACC CAG CAC AAT-3′，下游引物为 5′-GGG CCG GAC TCG TCA TAC-3′。 β-actin 作为内源对照，结果以相对定量2-ΔΔCt表示。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人肝癌细胞株 HepG2、MHCC-LM3 和 MHCCC-97H 均用含有10% 胎牛血清及青链霉素双抗(均为100 U/mL)的 DMEM 培养，常规培养于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数期细胞，按照每孔3×105个细胞接种于6孔板中，等到细胞密度大于80%时分别进行感染目的质粒(LV-DcR3)和空载质粒(LV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES)，感染前弃去培养基，更换新鲜培养基，根据上海吉凯基因化学技术有限公司病毒滴度测定结果按 MIO 50 TU/mL 加入病毒上清，37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h后更换培养基，72 h 后观察感染效率。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白 (GFP) 判断转染效率。继续进行下一步处理，分别收集 LV-NC组和LV-DcR3组细胞进行qPCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)、细胞生长曲线的检测。

1.2.2绘制细胞生长曲线 取对数期细胞，于6孔板接种2.5×104个细胞/孔，常规培养，时间点设置为0、2、4、6 d，弃上清，1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2次，10%福尔马林室温固定20 min，水洗1次，0.1% 结晶紫(溶解在10%乙醇中)室温染色至少30 min，流水清洗细胞外染液，完全晾干，10%乙酸溶解，分光光度计吸光度(A)590读取A值。以横坐标为时间(h)，纵坐标为A，绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。

1.2.3Western blot检测DcR3蛋白 采用细胞裂解液(RIPA)裂解细胞，BCA蛋白定量试剂盒定量后，加入 5×上样缓冲液(loading buffer)混匀，于 100 ℃变性10 min 进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿转 100 min，转移至 PVDF 膜上，5% 的脱脂奶粉封闭液封闭 2 h，一抗按比例加入，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBST) 漂洗3次，每次10 min。加入二抗，室温孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min，结果用化学发光试剂盒检测，曝光、显影、定影、观察结果，在相同的印迹上针对ACTB信号标准化成像条带的光密度，用凝胶成像仪对免疫印迹条带灰度值并进行分析。

1.2.4mRNA 表达水平检测 (1)细胞总 RNA 的提取：采用 Trizol法提取总 RNA，采用逆转录试剂盒将总 RNA 的1 μg mRNA 反转录成 cDNA，反转录的条件为42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。(2)qPCR：PCR反应体系为20 μL，每个孔设置3个复空，反应条件为预变性95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，40个循环。以β-actin作为内参，以2-ΔΔCt表示mRNA的相对定量，ΔCt=Ct靶基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。

2 结 果

2.1不同肝癌细胞株DcR3蛋白及mRNA的表达 采用Western blot检测3株肝癌细胞HepG2、MHCC-LM3和MHCC-97H的DcR3蛋白表达水平，发现MHCC-LM3[(0.258±0.058)]、MHCC-97H[(0.660±0.055)]较HepG2[(0.028±0.009)]细胞中的DcR3蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。在转录水平，发现HepG2 mRNA表达水平[(1.21±0.09)]较MHCC-97H[(8.56±0.46)]和MHCC-LM3[(5.27±0.23)]均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，本研究选取了肝癌细胞株HepG2,见图1。

注：A表示不同肝癌细胞株DcR3蛋白表达水平比较；B表示HepG2、MHCC-LM3和MHCC-97H mRNA表达水平比较；**P<0.05，与HepG2 mRNA表达水平比较

图13株肝癌细胞HepG2、MHCC-LM3和MHCC-97H的DcR3蛋白和mRNA表达水平

2.2LV-DcR3组、LV-NC组肝癌细胞HepG2内DcR3 mRNA及蛋白的表达 DcR3过表达慢病毒LV-DcR3感染HepG2后，LV-DcR3组蛋白表达水平[(2.44±0.43)]高于LV-NC组[(0.31±0.23)]。同时，在转录水平，LV-DcR3组mRNA表达水平[(35.276±8.627)]均明显高于LV-NC组[(0.973±0.014)]，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示过表达质粒转染效果良好，见图2。

注：A表示DcR3过表达慢病毒LV-DcR3感染HepG2后DcR3蛋白表达水平比较；B表示两组mRNA表达水平比较；*P<0.05，与LV-NC组比较

图2DcR3过表达慢病毒LV-DcR3感染HepG2后DcR3蛋白和mRNA表达水平

2.3DcR3表达对肝癌细胞HepG2凋亡的影响 细胞凋亡指标半胱天冬酶-3(caspase3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA水平的结果显示，LV-DcR3组凋亡基因caspase3和Bax转录水平较LV-NC组均明显下降，抗凋亡基因Bcl-2转录水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.4DcR3表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响 绘制生长曲线：当培养第2天时，LV-DcR3组增殖速度[(9.95±3.06)]与LV-NC组[(5.06±3.11)]比较，差异无统计学意义(P=0.124)；当培养到第4天时，LV-DcR3组增殖速度[(39.45±3.61)]与LV-NC组[(25.98±5.34)]比较，差异具有统计学意义(P=0.022)；当培养到第6天时，LV-DcR3组增殖速度[(65.84±6.16)]与LV-NC组[(33.34±4.55)]比较,差异有统计学意义(P=0.002)，见图3。

表1 上调DcR3表达后凋亡指标转录水平

注：*P<0.05，与LV-NC组比较

图3HepG2细胞株增殖曲线

3 讨 论

肝癌是高度恶性的肿瘤，目前手术切除是首选的治疗方式，但因为肝癌的早期诊断率很低，大部分患者就诊时已处于疾病晚期，70%的肝癌患者往往在初次就诊时，就已经错过了最佳治疗时机[4]。因此，只有通过对于癌症的发生及其发展机制的不断深入研究，才能取得更有效的预防和治疗方法。大量研究证实，DcR3在肿瘤的发生、发展中起重要作用，DcR3基因作为TNFR超家族成员之一，与TNFR具有高度同源性，能够通过与Fas等介导细胞凋亡的蛋白分子配体相结合，阻断后者介导的细胞凋亡过程[5]；另外，DcR3基因能够通过多种途径阻断T细胞、自然杀伤细胞诱导的肿瘤细胞凋亡，从而促进恶性肿瘤的免疫逃逸[6]，在肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生与发展中扮演重要角色[7-9]。

为了探讨过表达DcR3对HepG2细胞DcR3蛋白表达、增殖和凋亡的影响，研究者构建了DcR3慢病毒载体，转染DcR3表达水平较低的HepG2细胞后，验证转染效率，上调DcR3的表达后可促进肝癌细胞株HepG2增殖和抗凋亡能力。

细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡方式，而异常的细胞凋亡往往会引起机体异常:凋亡不足会引发癌症[10]。Bcl-2基因是一种癌基因，它具有抑制凋亡的作用，大多数多细胞生物的自我调节性死亡均经过一个保守的程序性过程，几乎均由Bcl-2调控及实施的[11]。本研究通过上调HepG2肝癌细胞株的DcR3后，发现抗凋亡基因Bcl-2转录水平升高，而研究发现caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，活化的caspase-3可引起细胞凋亡，但这个过程可以被Bcl-2阻断[12]。本研究发现caspase-3转录水平明显下降，可能的机制为Bcl-2系统能够稳定线粒体膜，防止caspase3/细胞色素C等分子渗出而导致的细胞凋亡[13]，说明DcR3在肝癌的凋亡过程中起着重要作用，原因可能是Bcl-2参与了此过程，但具体机制仍需进一步探讨。

细胞生长曲线结果显示DcR3具有促进肝癌细胞的增殖作用。陶振洲等[14]通过下调DcR3表达发现可以明显降低肝癌细胞系HepG2细胞的增殖能力，与本研究结果一致，进一步证实了DcR3能够促进肝癌细胞的增殖。研究发现DcR3能够中和TLlA诱导的抗血管生成，而新生血管是肿瘤侵袭和转移的关键步骤[15]。GE等[16]研究发现DcR3通过P13K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖、侵袭、转移和上皮间质转化，提示DcR3与肿瘤增殖、侵袭与转移的相关性。

4 结 论

本研究通过体外试验探讨了DcR3对肝癌细胞凋亡和增殖的影响，发现DcR3具有促进肝癌细胞的增殖和抗凋亡作用，其机制可能是通过上调抗凋亡基因Bcl-2发挥作用的。其如何进行调控的仍需进一步研究，为肝癌细胞分子治疗靶点的筛选和预后判断提供理论基础，具有重要的理论和临床价值。