混合菌株发酵白菊薄荷红茶调味醋的研制

贺羽，李慧，王帅*

(1.徐州工程学院 食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221018；2.徐州工程学院江苏省 食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

发酵调味醋在我国古代秦朝的时候就已经产生，始终广泛盛行于东南亚地区、日韩和欧洲中东部各个国家，发酵过程中会产生对人体健康有益的多种物质[1]。经常饮用，可以达到保健、预防疾病、延长寿命和美容护肤的作用，因此发酵调味醋一直具有“养生饮料”、“保健醋品”等美誉[2]。黄山贡菊在安徽省黄山市的广大区域产量丰富，药用保健功能比较丰富，有清热泻火、祛除体内风邪、平胆明目、清冷解毒等效用，长时间饮用能防止中暑、祛除胸中烦闷、清净五脏、排除身体内毒素、提神明目、延年益寿，对多种疾病也可以起到预防的作用[3]。菊花中包含的黄酮类化合物对某些心血管疾病和脑血管系统有良好的治疗效果，还具有预防和治疗高血压和动脉硬化，以及降低血压和胆固醇的功效，还可以使冠状动脉扩张和防止血栓形成[4]。 薄荷在中国是常用的中药之一，对流行性感冒、头疼、目赤、身热、咽喉痛、牙龈肿痛等症有很好的治疗作用。红茶是一种以绿茶为基础的经发酵而制成的茶叶，在中国是6种茶中最有影响的茶种，同时中国也是世界上最早生产和以红茶为饮品的国家[5]。相关研究表明，红茶中的生物活性物质儿茶素和茶黄素也对人体的疾病起到防治的作用，可降低人体血浆内尿酸和其中C-反应蛋白量[6,7]，降低血糖浓度、甘油三脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的含量比例，同时增加血浆中的抗氧化剂，有利于使患心血管疾病的风险得以降低[8]。与此同时，红茶也具有防癌、抗肿瘤、预防慢性炎症、降低肥胖率、预防神经性疾病的功能[9]。

尽管发酵茶菌调味醋在中国有着悠久的历史，但它仍处于一个小范围内，是初级阶段的独立生产与消费。这种家庭文化，培养出来的发酵茶调味醋很容易被细菌污染，而且温度不容易控制，由于菌种容易退化，对大规模生产造成困难。目前，主要专注研究发酵菌株的菌种分离、代谢产物的鉴定以及菌种的抗菌性能等方面，最近几年，陆续发表了许多有关复合乳酸菌菌株研究的文章，但对其发酵的茶调味醋的研究所知甚少[10]。本实验主要研究在37 ℃培养箱条件下，不同单因素条件对复合发酵茶调味醋加工的影响。具体的研究内容包括：红茶的用量对调味醋的影响；黄山贡菊的用量对调味醋的影响；薄荷的用量对调味醋的影响；白砂糖的用量对调味醋的影响；混合菌株的接种量对调味醋的影响。从而通过响应曲面的方法确定一套合理的加工工艺。同时参考调味醋的口感、风味、色度、pH等指标完善配方，以确定此款发酵茶调味醋的风味和营养价值达到最佳时的原料配比，为进一步丰富复合发酵茶调味醋的种类、规模化生产建立一定的基础参考。

1 原料与设备

1.1 实验材料与试剂

实验用红茶：购自徐州大润发超市；黄山贡菊、薄荷叶：购自雅盛旗舰店；白砂糖：购自广州福正东海食品有限公司。发酵所用嗜酸乳杆菌LactobacillusacidophilusKP15、鼠李糖乳杆菌LactobacillusrhamnosusKP36和植物乳杆菌LactobacillusplantarumKP59为本课题组筛选保藏菌株，已经过毒理及益生检测。

1.2 主要仪器与设备

JA2104N型电子天平、电热恒温干燥机、台式低速离心机、色差仪、720 nm分光光度计、pH计、电磁炉、HPX-9052MBE电热恒温培育箱、存储罐、超净工作台。

2 实验方法

2.1 发酵方法

以红茶、黄山贡菊、薄荷叶和白砂糖为原料，再以一定的比例倒进水壶，加入1 L蒸馏水，煮沸后保持50 min，然后冷却，使用8层纱布进行过滤，再加入蒸馏水定容到原来体积，混匀。再经过121 ℃高温灭菌20 min，使之冷却到室温，再倒入标有刻度的发酵罐中，平均每罐150 mL，根据课题组的益生特性实验，L.acidophilusKP15、L.rhamnosusKP36和L.plantarumKP59添加比例为1∶2∶3，混合活化后，将10%的混合菌种发酵液接入发酵罐中，37 ℃厌氧发酵48 h，制得发酵茶饮。工艺流程如下：

2.2 感官评定指标

感官评分：随机寻找30名具有专业水平的感官评定员组成感官评定小组对白菊薄荷红茶发酵调味醋进行感官评定，打出分数。感官评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table 1 The sensory evaluation standard

评定员按照表1中的各项指标给该醋饮打分，并记录下来，最终计算出感官评定的总分。通过对调味醋感官总分的分数高低结合各项指标得分来评价产品风味的优劣。

2.3 色差仪测定醋饮色度

测定方法：采用WF32-8MM色差仪测定各种原料比例制作而成的发酵调味醋的色差 L值、a值、b值，取平均值。目前最常用的表示颜色的方法是L、a、b颜色空间法，L值表示样品颜色的亮度，L值越大，样品越澄清透明；a值表示红绿色方向，a值为正值表示样品红色方向的程度值，a值为负值表示样品绿色方向的程度值；b值表示黄蓝色方向，b值为正值表示样品黄色方向的程度值，b为负值表示样品蓝色方向的程度值。L值、a值、b值是红茶调味醋外观评定的一项指标，不但能用来测量发酵调味醋的亮度，更能对醋饮的色泽等给予客观的量化评价[11]。

2.4 pH计测定发酵醋饮的酸度

白菊薄荷红茶发酵调味醋pH值的测定：用蒸馏水冲洗电极3～5次，用滤纸吸干，然后将电极放入样品中，待pH 值稳定后读数，每个样品重复测定3次，记录数据。测定完毕后，将电极清洗干净，把电极浸泡在蒸馏水中，将样品的pH值记录成表。

2.5 苯酚-硫酸法测定总糖含量(以葡萄糖计)[12]

2.5.1 标准曲线的制备

准确称取标准葡萄糖62.5 mg于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。然后分别移取4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 mL到5支100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。再取出5个试管，用移液枪准确移取上述溶液各1.0 mL分别放入试管中，再分别加入5.0 mL浓硫酸和2.0 mL 50 g/L的苯酚溶液，用蒸馏水定容，在室温下放置显色40 min后于490 nm处测定吸光度，另以1.0 mL蒸馏水按同样显色操作为空白。以测量出的吸光度值Y为纵坐标，葡萄糖的毫克数X为横坐标作图，能够得到标准曲线。

2.5.2 发酵醋饮样品的测定

取50 mL干燥离心管，称取空管质量。准确称取发酵茶培养液5 mL，加入无水乙醇至终体积的90%，经离心机离心15 min，倒掉上清液，烘干，称离心管及沉淀质量，计算粗多糖质量。然后用移液枪准确移取50 mL蒸馏水将其复溶，准确移取10 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，再次定容。移取上述溶液1.0 mL于10 mL试管中，使用和制作标准曲线相同的实验方法，测定吸光度，重复3次，代入葡萄糖标准曲线回归方程，通过计算得到多糖含量的平均值(以葡萄糖计)，从而计算糖利用率。

3 结果与分析

3.1 白菊薄荷红茶发酵醋饮的感官实验评定

用红茶使用量、黄山贡菊使用量、薄荷使用量、混合菌株发酵液使用量、白砂糖使用量做单因素实验，从而分析5个因素对白菊薄荷红茶发酵调味醋风味的影响。感官评分结果见表2～表6。

表2 红茶用量对感官品质的影响Table 2 The effect of black tea additive amount on sensory quality

表3 白菊用量对感官品质的影响Table 3 The effect of white chrysanthemum additive amount on sensory quality

表4 薄荷用量对感官品质的影响Table 4 The effect of mint additive amount on sensory quality

表5 白砂糖用量对感官品质的影响Table 5 The effect of sugar additive amount on sensory quality

表6 混合菌株接种量对感官品质的影响Table 6 The effect of mixed-strains inoculation amount on sensory quality

续 表

通过对上述感官评分进行分析，可绘制红茶用量、白菊用量、薄荷用量、白砂糖用量、混合菌种发酵液接种量对白菊薄荷红茶调味醋感官评分的影响曲线，见图1。

图1 各因素对发酵调味醋感官品质的影响Fig.1 The effect of each factor on sensory quality of fermented seasoning vinegar

注：A为红茶用量对感官品质的影响；B为白菊用量对感官品质的影响；C为薄荷用量对感官品质的影响；D为白砂糖用量对感官品质的影响；E为复合菌种发酵液接种量对感官品质的影响。

由图1可知，白菊薄荷红茶调味醋的红茶用量在5～8 g/L之间品质较好，各项指标及总分较高，白菊用量在6～10 g/L时风味怡人，薄荷用量在2～6 g/L、白砂糖用量在40～60 g/L、混合菌菌液接种量在5%～15%之间时口味达到最好。综上所述，白菊薄荷红茶发酵调味醋达到风味最佳的配方范围为：红茶用量在5～8 g/L，白菊用量在6～10 g/L，薄荷用量在2～6 g/L，白砂糖用量在40～60 g/L，菌液接种量在5%～15%。

3.2 色差仪测定醋饮色度

用WF32-8MM色差仪测定各成品发酵调味醋的L值、a值、b值，测定3次，取平均值，记录数据，见表7～表12。

表7 红茶加入量对色泽的影响Table 7 The effect of black tea additive amount on color

由表7可知，在其他发酵条件不变的情况下，发酵调味醋的L值随着红茶加入量的增加先上升再下降而后再上升，在红茶用量为6 g/L时，L值最大，为16.76； a值随着红茶加入量的增加逐渐下降，最后趋于平稳；b值随着红茶用量的增加先上升后下降再上升。所以，红茶用量为6 g/L时，发酵调味醋澄清透明，颜色为橙黄色，色泽明亮，感官效果极好。

表8 白菊加入量对色泽的影响Table 8 The effect of white chrysanthemum additive amount on color

续 表

由表8可知，在其他发酵条件不变的情况下，发酵调味醋的L值随着白菊加入量的增加而上升，总体比较稳定，L值在15左右；a值随着白菊加入量的增加先上升后下降；b值随着白菊用量的增加先上升后下降。所以，当白菊用量为8 g/L时，发酵调味醋澄清透明，颜色为橙黄色，色泽明亮，感官效果极好。

表9 薄荷加入量对色泽的影响Table 9 The effect of mint additive amount on color

由表9可知，在其他发酵条件不变的情况下，发酵调味醋的L值随着薄荷加入量的增加先下降后上升，当薄荷用量为2 g/L 或8 g/L时，L值在15左右；a值随着薄荷加入量的增加先下降后上升；b值随着薄荷用量的增加先上升后下降。所以，当薄荷用量为2 g/L或8 g/L时，发酵调味醋澄清透明，颜色为橙黄色，色泽明亮，感官效果极好。

表10 白砂糖加入量对色泽的影响Table 10 The effect of sugar additive amount on color

由表10可知，在其他发酵条件不变的情况下，发酵调味醋的L值随着白砂糖加入量的增加而上升，当白砂糖用量为50 g/L或超过50 g/L时，L值在14左右；a值随着白砂糖加入量的增加逐渐下降；b值随着白砂糖用量的增加先下降后上升。所以，当白砂糖用量为50～70 g/L之间时，发酵调味醋澄清透明，颜色为橙黄色，色泽明亮，感官效果极好。

由表11可知，在其他发酵条件不变的情况下，发酵调味醋的L值随着菌液接种量的增加呈逐渐下降趋势，但除了菌液接种量为20%时，其他条件下L值都较高；a值随着菌液接种量的增加呈下降趋势；b值随着菌液接种量的增加也呈下降趋势。所以，当菌液接种量为5%～15%之间时，发酵调味醋澄清透明，颜色为橙黄色，色泽明亮，感官效果极好。

3.3 醋饮有效酸度的测定结果

利用pH计测定白菊薄荷红茶发酵调味醋的有效酸度，实验结果见表12。

表12 醋饮样品的标准酸度Table 12 The standard acidity of vinegar sample

在食品检测中，测量发酵调味醋的有效酸度对描述该醋饮的品质具有重要意义。有关研究显示，市场上的维他命水、果珍、茉莉花茶的有效酸度大多分别为3.27，3.39，5.85[13]。由表12可知，白菊薄荷红茶发酵调味醋的有效酸度范围在2.90～4.78，由此可见，该发酵调味醋风味甚佳，受广大消费者喜爱。

3.4 单因素实验总糖含量测定分析

3.4.1 葡萄糖标准曲线的制备

根据苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线，见图2。

以测定的标准葡萄糖溶液的吸光度值Y为纵坐标，葡萄糖的毫克数X为横坐标作图，可得标准曲线图(见图2)。然后对实验数据进行回归分析，可以得到葡萄糖标准溶液的回归方程为Y=1.032X-0.0044，R2=0.9989，表示葡萄糖质量在0.025～0.125 mg之间有良好的线性关系。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 The standard curve of glucose

3.4.2 加入量对发酵效果的影响

红茶的加入量分别为4，6，8，10 g/L，复合菌种发酵液接种量为10%，贡菊加入量为6 g/L，薄荷叶加入量为4 g/L，白砂糖加入量为50 g/L，于37 ℃发酵4 d；在其他制作条件及原料加入量一定时，总糖利用率随着红茶加入量的增加先上升后下降，在红茶加入量为6 g/L时总糖利用率最高，综上，要使总糖利用率最高，红茶加入量应为6 g/L。贡菊的加入量分别为6，8，10，12 g/L，红茶加入量为6 g/L，复合菌种发酵液接种量为10%，薄荷加入量为4 g/L，白砂糖加入量为50 g/L， 于37 ℃发酵4 d；在其他制作条件及原料加入量一定时，总糖利用率随着贡菊加入量的增加先上升再下降又缓慢上升，在贡菊加入量为8 g/L 时总糖利用率最高，综上，要使总糖利用率最高，贡菊加入量应为8 g/L。薄荷的加入量分别为2，4，6，8 g/L，红茶加入量为6 g/L，贡菊加入量为6 g/L，复合菌种发酵液接种量为10%，白砂糖加入量为50 g/L，于37 ℃发酵4 d；在其他制作条件及原料加入量一定时，总糖利用率随着薄荷加入量的增加先下降再上升，在薄荷加入量为8 g/L 时总糖利用率最高，综上，要使总糖利用率最高，薄荷加入量应为8 g/L。白砂糖的加入量分别为40，50，60，70 g/L，红茶加入量为6 g/L，贡菊加入量为6 g/L，薄荷加入量为4 g/L，复合菌种发酵液接种量为10%，于37 ℃发酵4 d；在其他制作条件及原料加入量一定时，总糖利用率随着白砂糖加入量的增加先上升再下降，在白砂糖加入量为50 g/L时总糖利用率最高，综上，要使总糖利用率最高，白砂糖的加入量应为50 g/L。复合菌株发酵液接种量分别为5%、10%、15%、20%，红茶加入量为6 g/L，贡菊加入量为6 g/L，薄荷加入量为4 g/L，白砂糖加入量为50 g/L，于37 ℃发酵4 d；在其他制作条件及原料加入量一定时，总糖利用率随着复合菌株发酵液接种量的增加先上升再下降，在菌液接种量为10%时总糖利用率最高，综上，要使总糖利用率最高，菌液接种量应为10%，实验结果见图3。

图3 各因素加入量对糖的利用率Fig.3 The utilization rate of each factor additive amount on sugar

注：A为红茶用量对糖利用率的影响；B为白菊用量对糖利用率的影响；C为薄荷用量对糖利用率的影响；D为白砂糖用量对糖利用率的影响；E为复合菌种发酵液接种量对糖利用率的影响。

3.5 Box-Benhnken实验设计

3.5.1 白菊薄荷红茶发酵茶醋饮糖利用率统计

根据单因素实验结果，利用 Box-Benhnken实验设计，以总糖的利用率为响应值，综合单因素实验结果，考察复合菌种发酵液接种量、白糖加入量、白菊加入量3个因素的相互作用，并进行响应面分析，对发酵工艺条件进行优化。取之前单因素最优点两侧的数值得到三因素三水平，通过软件分析得到所需要的17组数据，分别进行实验，见表13。

表13 产品响应指标结果Table 13 The results of product response indexes

3.5.2 方差分析及响应面法分析

利用方差分析法对实验数据进行分析，结果见表14。利用软件 Design-Expert 8.0.6对结果进行分析，得到糖利用率与复合菌种发酵液接种量、白菊加入量与白糖加入量间的拟合回归模型：

糖利用率=+82.05-0.11A-0.44B+0.54C-0.41AB+0.14AC-0.015BC-1.44A2-2.05B2-1.17C2。

式中：A为复合菌种发酵液接种量；B为白糖加入量；C为薄荷加入量。

表14 方差分析表Table 14 The analysis of variance table

由表14可知，总回归的F值为5.84， p值为0.0149(0.01

图4 复合菌种发酵液接种量与白糖加入量 响应曲面图(A)与等高线图(B)Fig.4 Response surface diagram (A) and contour diagram (B) of inoculation amount of mixed-strains fermentation liquid and additive amount of sugar

由图4可知， 当菌液接种量在9.0%时，糖利用率随着白糖加入量的增加先上升后下降。当接种量在10.0%左右时，糖利用率随着白糖加入量的增加先增加，在白糖加入量为50.0 g/L左右时达到一个峰值，然后下降。当白糖加入量为45.0 g/L时，糖利用率随着菌液接种量的增加先上升后下降。当白糖加入量在50.0 g/L左右时，糖利用率随着菌液接种量的增加先增加，在接种量为10.0%左右时达到峰值，然后下降。

图5 复合菌种发酵液接种量与薄荷加入量 响应曲面图(A)与等高线图(B)Fig.5 Response surface diagram (A) and contour diagram (B) of inoculation amount of mixed-strains fermentation liquid and additive amount of mint

由图5可知，当菌液接种量为9.0%时，糖利用率随着薄荷加入量的增加缓慢增长，趋势不明显，影响不大。当菌液接种量为10.0%左右时，糖利用率随着薄荷加入量的增加先上升，在薄荷加入量为8.0 g/L左右时达到一个峰值，然后下降。当薄荷加入量为7.0 g/L时，糖利用率随着复合菌种发酵液接种量的增加先缓慢上升再缓慢下降。当薄荷加入量为8.0 g/L左右时，糖利用率随着菌液接种量的增加先上升，在菌液接种量为10.0%左右时达到峰值，然后下降。

图6 白糖加入量与薄荷加入量响应曲面图(A) 与等高线图(B)Fig.6 Response surface diagram (A) and contour diagram (B) of additive amount of sugar and mint

由图6可知，当白砂糖加入量为45.0 g/L时，糖利用率随着薄荷加入量的增加先上升后下降。当白砂糖加入量在50.0 g/L左右时，糖利用率随着薄荷加入量的增加先增加，在白糖加入量为50.0 g/L左右时达到峰值，然后下降。当薄荷加入量为7.0 g/L时，糖利用率随着白砂糖加入量的增加先缓慢上升再缓慢下降。当薄荷加入量为8.0 g/L左右时，糖利用率随着白砂糖加入量的增加先上升，在白砂糖加入量为50.0 g/L左右时达到峰值，然后下降。

所以，经过 Design-Expert 8.0.6 软件分析得到，在复合菌种发酵液接种量为9.99%、白砂糖加入量为49.89 g/L、薄荷加入量为8.23 g/L时，糖利用率达到最高，为82.134%。

3.6 验证实验

通过对响应曲面得到的最佳方案为：复合菌种发酵液接种量9.99%，白砂糖加入量49.89 g/L，薄荷加入量8.23 g/L，根据所得数据，做一组验证实验，见表15。

表15 数据分析后最佳方案的糖利用率Table 15 The sugar utilization rate of optimal scheme after data analysis

由表15可知，糖利用率最高为82.134%，实际验证实验所得糖利用率最高为79.65%，两者相差不大。因此，结合感官评定及有效酸度确定调味醋的最佳条件为菌液接种量10.0%，白糖加入量50.0 g/L，薄荷加入量8.2 g/L，红茶加入量6 g/L，白菊加入量8 g/L。

4 讨论

本实验采用单因素法和响应面法优化复合菌种发酵液的发酵工艺，结合总糖利用率(以葡萄糖计)得到最佳工艺条件。结果表明，白菊薄荷红茶发酵调味醋的最佳配方为每1 L醋饮中，红茶用量为6 g，白菊用量为8 g，薄荷用量为8.2 g，白砂糖用量为50 g，复合菌种发酵液接种量为10%。在此工艺条件下，在37 ℃的环境中发酵4 d，白菊薄荷红茶发酵调味醋的口感良好，色泽和气味比较受人喜爱，并且此时醋饮中的总糖利用率最高，营养价值也处于最佳阶段，比普通的红茶醋饮略胜一筹。因为其出色的口感、良好的色泽与怡人的香气，再加上特有的保健功能，对于现在快节奏生活的年轻消费者和大部分老年消费者来说，不愧是最佳的选择。与此同时，通过感官评定、pH的测定等方法，对发酵调味醋的口感、风味具有一定的参考和改善，可以使发酵调味醋在具备最佳保健功能的同时，不失其风味与色泽，使其成为一种风味独特、营养健康的复合发酵调味醋，适合男女老少日常保健饮用。这几者相结合，制成风味独特的复合型发酵醋饮品，用普通的食材，使广大普通人群享受到很好的保健方式。未来，像贡菊、薄荷这样日常饮用的茶品，经过专业的工艺条件，与红茶发酵而成的独特的功能性调味醋将成为普通家庭的日常必备，既丰富了调味品的口感、风味，又满足了饮用人群对饮料保健功能的需求。像发酵调味醋这样的许多民间传统文化，我们需要去发现并使它们发扬光大。随着社会的发展、人民生活水平的提高以及对养生的重视，这类产品将会更受青睐。