低聚壳聚糖制备的研究

朱新锋，黄永春*，杨锋，张昆明

(1.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；2.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006)

壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后得到的一种碱性氨基多糖，因其具有优良的生物降解性、吸附性和低毒性等优点[1]，在食品、化工、生物和医药等领域得到了广泛的应用[2-4]，展现出了独特的应用价值。然而，由于壳聚糖分子量较大，不易溶于水和碱性溶液，只能溶于乙酸等弱酸性溶液，这极大地限制了壳聚糖在各领域的应用[5]。而低聚壳聚糖具有较好的水溶性、乳化性等功能特性[6]，已广泛应用于食品添加剂、调味品、食品保鲜等领域[7]。因此降解制备低聚壳聚糖是壳聚糖高值化利用的重要途径，但目前低聚壳聚糖生产能力还较低。因此研究一种高效、实用的壳聚糖降解方法势在必行。

本课题组已经研究了孔板水力空化、文丘里管、射流空化等物理方法对壳聚糖降解效果的影响，且均取得一定成效。撞击流技术作为一种新型的物理方法，具有无污染、高效率等优点，在工业废气处理、粉体制备、物料粉碎等领域已经取得了一定的进展。因此，本文应用撞击流技术对壳聚糖进行降解，研究不同的操作条件及结构参数对壳聚糖降解效果的影响，从而为制备低聚壳聚糖提供了一种新型方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖：工业级，上海卡博工贸有限公司；其余试剂均为分析纯。

BS224S型分析天平 德国赛多利斯股份有限公司；JS-510机械秒表 上海星钻秒表有限公司；乌氏粘度计(0.57 mm) 上海良晶玻璃仪器厂；HK-1D型恒温水浴槽 南京物化智能设备有限公司；GM-0.33隔膜真空泵 天津市腾达过滤器件厂；NICOLET 6700红外光谱仪；TG209F1热重分析仪;Waters 1515凝胶渗透色谱仪；撞击流装置：本实验室自制，装置示意图见图1；撞击流装置结构示意图见图2。

图1 撞击流装置示意图Fig.1 Schematic diagram of impinging stream device

注：1为溶液贮箱；2为离心泵；3为撞击流装置；4为压力表；V为阀门。

图2 撞击流装置结构示意图Fig.2 Schematic diagram of the structure of impinging stream device

注：α为撞击角度；D为出口直径；D1为喷嘴直径(10 mm)。

1.2 分析方法

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 初始浓度对降解效果的影响

将壳聚糖溶解到0.2 mol/L醋酸-0.1 mol/L醋酸钠缓冲液中配成浓度分别为1，3，5，7，10 g/L的壳聚糖溶液，并调节溶液的pH至4.4，保持反应温度为40 ℃，调控反应流速为4.2 m/s，通过撞击角为90°、出口直径为10 mm的撞击流反应器装置循环40 min，测定壳聚糖溶液的特性粘度在反应前和反应后的变化并分析壳聚糖初始浓度对降解效果的影响。

1.2.1.2 溶液pH对降解效果的影响

将壳聚糖溶解到0.2 mol/L醋酸-0.1 mol/L醋酸钠缓冲液中配成浓度为3 g/L的壳聚糖溶液，调节溶液的pH分别为3.2，3.6，4.0，4.4，4.8，保持反应温度为40 ℃，调控流速为4.2 m/s，通过撞击角为90°、出口直径为10 mm的撞击流反应器装置循环40 min，测定壳聚糖溶液的特性粘度在反应前和反应后的变化并对不同pH对降解效果的影响进行分析。

1.2.1.3 反应时间对降解效果的影响

将壳聚糖溶解到0.2 mol/L醋酸-0.1 mol/L醋酸钠缓冲液中配成浓度为3 g/L的壳聚糖溶液，并调节溶液的pH至4.4，调控流速为4.2 m/s，保持反应温度为40 ℃，通过撞击角为90°、出口直径为10 mm的撞击流反应器装置循环260 min，每20 min测定壳聚糖溶液的特性粘度在反应前和反应后的变化并对反应时间对降解效果的影响进行分析。

1.2.1.4 溶液流速对降解效果的影响

将壳聚糖溶解到0.2 mol/L醋酸-0.1 mol/L醋酸钠缓冲液中配成浓度为3 g/L的壳聚糖溶液，并调节溶液的pH至4.4，保持反应温度为40 ℃，通过控制撞击流的阀门，调控流量为20，60，110，160，190，210，230 mL/s，通过撞击角为90°、出口直径为10 mm的撞击流反应器装置循环40 min，测定壳聚糖溶液的特性粘度在反应前和反应后的变化并对溶液流速对降解效果的影响进行分析。

1.2.1.5 撞击流反应器结构对降解效果的影响

将壳聚糖溶解到0.2 mol/L醋酸-0.1 mol/L醋酸钠缓冲液中配成浓度为3 g/L的壳聚糖溶液，并调节溶液的pH至4.4，调控流速为4.2 m/s，控制撞击角度为30°、45°、60°、90°，循环反应40 min，测定壳聚糖溶液的特性粘度在反应前和反应后的变化并对不同撞击角度的撞击流装置对降解效果的影响进行分析。

1.2.2 特性粘度下降率的测定

通过特性粘度下降率进行表征[8]：

式中：ηo，ηt是反应前后溶液的特性粘度，mL/g。用乌式粘度计在(30±0.1) ℃条件下测定壳聚糖溶液的特性粘度，壳聚糖溶液流出时间为t，溶剂流出时间为t0，用文献[9]的方法计算特性粘度。

1.2.3 凝胶渗透色谱分析

本实验采用型号为Waters 1515(美国)的凝胶渗透色谱仪对壳聚糖样品及降解产物进行分析，保持壳聚糖溶液的浓度为3 g/L，调节溶液的pH为4.4，使溶液温度保持在40 ℃，流速为4.2 m/s的条件下，溶液在撞击流反应器中循环反应100 min，每隔20 min取样1次，利用凝胶渗透色谱法对壳聚糖的分子量分布进行测定。

1.2.4 红外光谱分析

采用红外光谱仪对壳聚糖样品及其降解产物在400～4000 cm-1波数范围内进行扫描，通过分析光谱图中吸收峰的位置和形状，从而推断壳聚糖降解前后基本结构的变化。

2 实验分析

2.1 壳聚糖的降解效果

2.1.1 初始浓度的影响

图3 壳聚糖浓度对降解效果的影响Fig.3 Effect of chitosan concentration on degradation

由图3可知，壳聚糖溶液的浓度对降解效果的影响非常显著。当壳聚糖溶液浓度从1 g/L增加到10 g/L时，特性粘度下降率从67.6%降低到3.7%。说明低浓度壳聚糖溶液有利于降解。其原因：一方面，溶液浓度越大，粘度越大，壳聚糖分子在相同的碰撞条件下，每个壳聚糖分子能够获得的断链的机械能减少，并且分子之间碰撞及摩擦的作用力减小，因此由碰撞转变成的应变能减小[10]，从而导致壳聚糖分子内化学键断裂的数量减少，故降解效果减弱；另一方面，溶液浓度越大，其粘度越大，会使碰撞瞬间产生速度梯度下降的程度减弱，导致机械剪切效应变小，从而减弱了降解效果。

2.1.2 溶液pH对降解效果的影响

图4 pH对降解效果的影响Fig.4 Effect of pH on degradation

由图4可知，溶液的pH值是撞击流技术降解壳聚糖的重要影响因素。pH在3.2～4.4之间时，随着溶液pH的升高，特性粘度下降率也随之增加，当pH>4.4时，溶液的特性粘度下降率反而减小。这是因为当pH较小时，溶液中氢离子浓度高，导致阴离子的浓度也增加，壳聚糖分子形成的盐键增多[11]，导致壳聚糖分子的伸展程度减弱，壳聚糖分子在相同的撞击力、剪切力、摩擦力的作用下，降低了分子的降解速度[12]；另外，壳聚糖降解是在酸性条件下催化反应，只有在酸性条件下才能进行，而pH太大不利于降解反应的进行。

2.1.3 反应时间对降解效果的影响

图5 反应时间对降解效果的影响Fig.5 Effect of reaction time on degradation

由图5可知，壳聚糖降解过程中，在反应前80 min，溶液特性粘度下降率升高很快，但是，延长壳聚糖溶液在反应器中的反应时间，发现壳聚糖溶液的特性粘度下降率升高幅度逐渐变缓。这是因为反应初期壳聚糖分子链较长，在撞击流反应器中，由于机械剪切效应使长链断裂，形成很多短链壳聚糖分子。当短链壳聚糖分子再通过撞击流反应器时，由于壳聚糖分子的分子链已经很短，所以断键的能力减弱。所以，降解率呈现先直线升高后趋于平缓的趋势。因此，既要提高壳聚糖降解效果，又要降低能耗，实验选取的反应时间不宜过长。

2.1.4 溶液流速对降解效果的影响

图6 流速对降解效果的影响Fig.6 Effect of flow velocity on degradation

由图6可知，在降解反应中，随着流速的增大，壳聚糖溶液特性粘度下降率随之升高。当流速达到190 mL/s时，特性粘度下降率升高的幅度突然增加。这是因为：一方面，溶液中通过喷嘴进入撞击区的壳聚糖分子之间的剪切力与溶液的速度和密度成正比[13]。相同条件下，液体的流速决定了壳聚糖分子承受剪切力的大小。高速对撞过程中，流速的大小即分子承受剪切力的大小，流速越大，壳聚糖分子所受的剪切力越大，分子越容易断键，所以降解效果越显著；另一方面，当流速增加时，流体间湍流程度加强，分子间碰撞更加剧烈，使化学键更容易断裂，从而导致壳聚糖特性粘度下降率升高。因此，较大的流速有利于壳聚糖溶液的降解。

2.1.5 撞击角度对降解效果的影响

由图7可知，撞击角度的改变对壳聚糖特性粘度下降率的影响具有差异性。当撞击角度较小时，撞击区流体的湍动程度较小，液体以“Y”形流出；随着撞击角度的增大，对撞明显加强，壳聚糖溶液的降解效果得到加强，当撞击角度为90°时，特性粘度下降率最大。这是因为随着撞击角度的增大，撞击流反应器中两股流体分别从喷嘴射入到撞击面的过程中，轴向速度逐渐减小，径向速度逐渐增大，对撞程度明显增强，同时撞击面处的湍流程度增加，这两股流体的动能最大程度地转化为碰撞时的撞击力、剪切力等，从而提高了壳聚糖的降解率。

图7 撞击角度对降解效果的影响Fig.7 Effect of impinging angle on degradation

2.2 凝胶渗透色谱分析

图8 不同时间降解产物的凝胶渗透色谱图Fig.8 Gel permeation chromatogram of degradation products at different time

由图8可知，随着壳聚糖溶液反应时间的延长，降解产物的色谱峰向保留时间较高的方向偏移，其峰形未发生明显变化，说明壳聚糖在撞击流反应器作用下发生了降解，大分子不断减少，小分子不断增多，其平均分子量降低，且分散指数未发生变化。

2.3 红外光谱分析

图9 壳聚糖样品及降解产物的红外谱图Fig.9 Infrared spectra of chitosan samples and degradation products

由图9可知，位于1051，1081 cm-1处的吸收峰明显增强，说明壳聚糖分子中的C-O键发生了变化，表明壳聚糖的降解主要发生在主链上；在1690，1548，1340 cm-1附近的吸收峰也没有明显差异，可知降解过程中-NH2的数量基本没有变，酰胺结构也没有发生太大变化；此外，在895 cm-1附近的吸收峰表明壳聚糖的主链仍是环状结构。由以上结果可知，壳聚糖分子经撞击流技术降解后，其官能团和结构单元基本没有变，撞击流降解主要是切断了壳聚糖的β-(1,4)-糖苷键[14]，此降解方式并不改变降解产物的结构。

3 结论

实验结果表明：壳聚糖溶液浓度越低，降解效果越好，当溶液浓度为1 g/L时，特性粘度下降率达到最高，为67.6%。随pH增大，壳聚糖降解效果先增强后减小，当pH为4.4时壳聚糖降解效果最好；壳聚糖降解率随着流量的增大而升高，当流速在190～230 mL/s时升高的趋势较为明显，当流量为230 mL/s时，特性粘度下降率最大，达到48.5%；随着反应时间的延长，壳聚糖降解率呈现升高的趋势，升高的幅度逐渐减弱；当撞击角度为90°时，壳聚糖的特性粘度下降率最大；撞击流技术能有效降解壳聚糖，且糖链的断裂主要发生在主链的β-(1,4)-糖苷键上。