紫皮豇豆多酚类物质的含量及其降糖活性研究

吴琼，王明月，吕岱竹，林冰，陈健

(1.中国热带农业科学院分析测试中心，海口 571101；2.农业部热作产品质量安全风险评估实验室(海口)，海口 571101；3.海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海口 571101)

紫皮豇豆(Vignaunguiculatassp. Cylindrica)，蔓生，豆科一年生草本植物，因荚的颜色为紫红色而得名，耐热，适合夏季种植[1，2]。研究显示：紫皮豇豆内富含维生素、脂肪、膳食纤维、微量元素和植物蛋白等营养物质，所含多酚类物质具有超强的抗氧化能力[3]，有助于人体抵御癌症、心血管疾病及与机体衰老相关的疾病，是优良的保健蔬菜，具有较高的保健价值[4]。目前，发达国家普遍通过脱水、冷冻等方式对其进行加工，贮藏量与加工量已经占到所产蔬菜总量的80%。另外，因其具有质地脆嫩、含水量不高的特征，适宜进行腌制加工，腌制生产在我国比较普遍。紫皮豇豆是现代家庭、餐馆、航海和军队等理想的常备美味、健康食品。

测定植物总多酚的方法有很多，有高锰酸钾滴定法、色谱法及光谱法等[5-11]。其中，高锰酸钾滴定法是较为传统的检测方法，利用高锰酸钾的强氧化性与被测物中的还原性物质作用，此方法的选择性低、误差大。常用的色谱法有高效液相色谱法(UV、DAD)、气相色谱法、气相色谱-质谱法(质谱-选择离子监测法)、液相色谱-质谱法等，色谱法所用仪器价格昂贵，而且需要大量的标准品定性、定量，成本较高，仅适用于单体成分的检测。光谱分析测定法是基于显色反应测定样品中的多酚含量，常用的方法有可见光分光光度测定法、酒石酸亚铁分光光度法、福林-酚比色法等[12，13]。本试验选用福林-酚比色法测定紫皮豇豆中的多酚含量，该方法具有成本低、操作简单等优点。

目前对紫皮豇豆营养物质的研究主要停留在常规的营养物质上，如蛋白质、淀粉和维生素等[14，15]，而真正具有食疗保健作用的功能性营养物质，尤其是具有降糖活性的功能性营养物质报道较少。张红梅等发现紫红豇豆中花青素的总量明显高于绿豇豆和白豇豆[16]；隋华嵩等研究发现，紫皮豇豆中的紫红色素水溶性良好，并测定了紫皮豇豆豆荚与种子紫红色素的紫外最大吸收波长[17]。目前，尚未发现对紫皮豇豆中具有降糖活性成分的相关研究。本试验采用溶剂提取法提取紫皮豇豆中的多酚，再利用福林-酚比色法测定紫皮豇豆中的总多酚含量，最后利用体外降糖试验评价紫皮豇豆多酚的抗α-葡萄糖苷酶活性，为进一步开发紫皮豇豆中的天然、有效且无毒副作用的功能性营养成分，辅助治疗糖尿病提供了试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫皮豇豆：海口市，市售，新鲜。

没食子酸标准品：纯度≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司；福林酚试剂、无水碳酸钠：均为分析纯；丙酮：色谱纯；α-葡萄糖苷酶：100 U，上海源叶生物科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷：pNPG，上海源叶生物科技有限公司；KH2PO4、K2HPO4：广州化学试剂厂。

1.2 主要仪器设备

Synergy 2多功能微孔板检测仪；晶安石英96孔酶标板；微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司；CR22N高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；冷冻干燥机 北京四环科学仪器有限公司；电子天平、移液枪以及其他实验室常用仪器设备。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制和样品的制备

称取0.04 g没食子酸标准品，用高纯水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为400 μg/mL的没食子酸标准溶液；称取0.01 g阿卡波糖标准品，用高纯水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为100 μg/mL的阿卡波糖母液，稀释可得1 μg/mL阿卡波糖标准溶液。

称取50 g紫皮豇豆样品，加入盛有500 mL(固液比1∶10)80%丙酮水溶液的装有蛇形冷凝管的圆底烧瓶中，置于50 ℃水浴中提取5 h，在此过程中需震摇2～3 次，待提取液冷却后过滤，过滤物再重复提取2次。合并滤液，在 45 ℃下于旋转蒸发仪中除去丙酮，剩余溶液经过冷冻干燥得到多酚提取物2.32 g，分取0.1 g紫皮豇豆多酚提取物于10 mL容量瓶中加水溶解后定容，制成紫皮豇豆多酚提取液，备用。

1.3.2 样品中总多酚含量的测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制

取5支10 mL容量瓶，分别加入0，0.05，0.1，0.25，0.4，0.6 mL没食子酸标准溶液，加入4 mL蒸馏水，混匀后加入0.5 mL福林酚试剂，大约30 s后再加入4 mL 8%碳酸钠溶液，再用高纯水定容至10 mL，室温下反应30 min后，在740 nm下扫描，以没食子酸质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2.2 样品的测定

吸取0.3 mL紫皮豇豆多酚提取液和没食子酸标准溶液分别置于10 mL容量瓶中，按1.3.2.1方法反应后上机，计算样品中总多酚的含量。

1.3.3 多酚提取物降糖活性试验

在96孔板中分别加入0.5 mL多酚提取液和阿卡波糖标准溶液，再分别加入0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶及67 mmol/L pH 6.9的磷酸钾缓冲液各20 μL，37 ℃预保温15 min后，加入20 μL 6 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，在37 ℃酶解15 min，加80 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液终止反应，每个处理分别做4个重复，在415 nm波长下测定吸光值。

1.3.4 方法评价

1.3.4.1 重复性

取5支容量瓶，分别吸取0.3 mL同一批次提取的紫皮豇豆多酚提取液，按照1.3.2.1条件反应后测其吸光度，计算相对标准偏差。

1.3.4.2 加标回收率

取6支10 mL容量瓶，分别加入0.2 mL多酚提取液，再分别加入0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.25 mL 的400 μg/mL没食子酸标准溶液，按1.3.2.1条件反应后测其吸光度，测定没食子酸的回收率，计算结果的相对标准偏差。

1.3.4.3 抑制率曲线的绘制

将阿卡波糖标准溶液和多酚提取液分别稀释2，10，50，250，1250倍，按1.3.3条件反应后测定吸光度，绘制多酚提取液抑制率曲线。

2 结果与分析

2.1 最佳检测波长的确定

将紫皮豇豆多酚提取液与没食子酸标准溶液用福林-酚比色法，在400～800 nm波长范围内扫描，测定吸光度，扫描结果见图1。

图1 紫皮豇豆多酚和没食子酸的光谱吸收谱图Fig.1 Spectral absorption spectra of polyphenols of Vigna unguiculata and gallic acids

由图1可知，提取液与标准溶液的光谱曲线轮廓相同，可以选用没食子酸作为标准品对紫皮豇豆的总多酚进行定量，两者的最大吸收峰都在740 nm处，因此选择740 nm作为最佳检测波长。

2.2 样品总多酚含量的测定

图2 标准曲线Fig.2 Standard curve

以没食子酸量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线，没食子酸标准溶液在0～240 μg范围内呈现较好的线性关系。线性方程为：Y=0.0027X+0.083 ，相关系数为：R2=0.9933，其中Y为吸光度，X为没食子酸量。

测量样品中的多酚含量，见公式(1)：

(1)

式中：Xi为样品中总多酚含量(mg/100 g)；Ai为提取液吸光度；m为紫皮豇豆样品的质量(g)；M1为提取物冻干后的质量(g)；M2为分取的紫皮豇豆提取物质量(g)；V1为提取液上机液体积(mL)；V2为分取的紫皮豇豆提取物定容体积(mL)。

通过上述公式计算可得紫皮豇豆中总多酚的含量是614 mg/100 g。

2.3 方法评价

2.3.1 重复性实验

测定5组同一批次的紫皮豇豆多酚含量分别为596，643，589，648，595 mg/100 g，相对标准偏差(RSD)为3.7%，说明该方法具有较高的精密度。

2.3.2 加标回收实验

表1 总多酚含量测定方法的加标回收率Table 1 Recovery rates of determination method for total polyphenol content

由表1可知，在0～100 μg添加水平，方法的回收率为92.6%～116.0%，相对标准偏差小于10%，说明该方法准确可靠，可用于紫皮豇豆总多酚的测定。

2.4 提取液降糖活性的测定

样品抑制率按公式(2)计算：

酶活性抑制率(%)=[1-(Abs1-Abs2)/Abs0]×100。

(2)

式中：Abs1是样品组的吸光度；Abs2是不加酶组的吸光度；Abs0是不加样品组的吸光度。

通过上述公式计算可得紫皮豇豆多酚提取液的抑制率为100.5%，阿卡波糖为99.2%。

提取液和阿卡波糖标准溶液稀释后的抑制率见表2。

表2 稀释后提取液和阿卡波糖的抑制率Table 2 Inhibitory rates of diluted extract and acarbose

阿卡波糖作为已知的α-葡萄糖苷酶抑制剂，可减缓肠道内葡萄糖的吸收，其作用原理是竞争性地与α-葡萄糖苷酶结合，从而使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢。按照1.3.4.3的方法，平行测定阿卡波糖及提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

图3 酶活性抑制曲线Fig.3 Inhibitory curves of enzyme activity

由图3可知，提取液与阿卡波糖抑制曲线有相同的变化趋势，抑制率与相对浓度呈对数关系，随着相对浓度不断上升，对α-葡萄糖苷酶的抑制率不断增加，当相对浓度为0.1时，提取液与阿卡波糖抑制曲线均出现拐点，继续减少相对浓度，抑制率变化趋势放缓，进入平台期。阿卡波糖的抑制曲线方程为y=11.039In(x)+63.65，R2=0.8691；提取液的抑制曲线方程为y=12.762In(x)+113.24，R2=0.8805。经计算阿卡波糖的IC50为0.29 μg/mL，而紫皮豇豆提取液的IC50与阿卡波糖相近，为0.34 μg/mL。由此，可以推论紫皮豇豆多酚降糖原理与阿卡波糖相似，可以与α-葡萄糖苷酶结合，达到抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

3 结论

以没食子酸为对照品，建立了福林-酚比色法测定紫皮豇豆中总多酚的方法。结果表明，在0～240 μg没食子酸量与吸光度呈良好的线性关系，测定值为614 mg/100 g，平均加标回收率为103.6%，相对标准偏差为9.6%，该方法具有良好的选择性和灵敏度，适用于检测紫皮豇豆中总多酚的含量，也为不同作物中多酚含量的检测提供了依据和参考。另外，试验发现紫皮豇豆多酚提取物对α-葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用，抑制率接近相同浓度的阳性对照阿卡波糖，说明紫皮豇豆多酚对α-葡萄糖苷酶具有体外降糖活性。紫皮豇豆多酚是一种潜在的具有天然降糖活性的功能性营养食品，可用于辅助治疗糖尿病，值得进一步开发利用。