利拉鲁肽联合生长分化因子-11重组蛋白对db/db糖尿病小鼠的心肌保护作用及对TGF-β1、PPARγ和Caspase-3的影响

罗小莉 罗文杰 李敏 杨金蓉

(1雅安职业技术学院，四川 雅安 625000；2雅安市人民医院；3四川省成都中医药大学)

糖尿病心肌病是2型糖尿病(T2DM)的主要并发症之一〔1〕。利拉鲁肽(Li)是一种新型的治疗T2DM的药物，对糖尿病引起的肾脏炎症具有较好的治疗效果〔2〕。生长分化因子(GDF)-11是胚胎发育过程中的重要因子，并且在多种细胞的形成和分化中起着重要作用，有保护胰岛β细胞的作用，但是关于GDF-11对糖尿病心肌病的研究较少〔3〕。转化生长因子(TGF)-β1可通过调节胞外基质促进器官纤维化，也是引起心肌病的重要因素〔4〕。过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)γ具有调节代谢、抑制炎症反应的作用〔5〕。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行蛋白，参与糖尿病心肌细胞凋亡的发生〔6〕。本文主要分析Li联合GDF-11对db/db糖尿病小鼠的心肌保护作用，并通过分析其对TGF-β1、PPARγ和Caspase-3的影响分析其可能的机制。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 SPF级T2DM模型db/db小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju)及db/m小鼠购于南京大学模型动物研究所(SCXK(苏)2015-0001)。利拉鲁肽(诺和诺德，丹麦)。人重组GDF-11蛋白(Pepro Tech，美国)。苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色试剂盒购及酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美，中国)。TGF-β1一抗，PPARγ一抗，Caspase-3一抗及相应二抗购买于Abcam公司(美国)。聚偏氟乙烯(PVDF)膜购于Bio-Rad(美国)。逆转录试剂盒，SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa(日本)。PCR引物由Genewiz(苏州，中国)设计并合成。

1.2分组和处理方法 db/db小鼠48只随机分为模型组、Li组、GDF-11组及Li+ GDF-11组，每组12只；db/m小鼠12只为对照组。适应性喂养1 w后进行药物干预。Li组腹腔注射Li 1 mg/(kg·d)，1次/d；GDF-11组腹腔注射GDF-11 0.3 mg/(kg·d)，1次/d；Li+ GDF-11组同时注射Li和 GDF-11(剂量、用法同以上两组)。用药均8 w。

1.3观察指标

1.3.1小鼠活动状态及空腹血糖(FBG) 观察并记录干预后各组小鼠的活动状态，分别在干预前和干预后检测每只小鼠的FBG。

1.3.2HE染色 干预后将小鼠处死，取左心室组织，立即在甲醛中室温下固定24 h。酒精脱水，石蜡包埋。将样品切成4 μm厚的均匀薄片并置于APES涂覆的载玻片上。使用二甲苯将切片脱石蜡，水化，HE染色。采用苏木精在室温下温育5 min。洗涤后，用曙红在室温下温育1～3 min。梯度乙醇洗涤后，使用中性凝胶进行密封，显微镜下观察。

1.3.3Masson 染色 取心脏组织切片，使用Masson试剂染色，按照试剂盒说明书步骤操作，观察心肌组织纤维化情况，计算纤维化染色面积。

1.3.4ELISA检测心肌酶指标 小鼠眼眶取血，ELISA法检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，根据试剂盒说明书加入工作液，计算浓度。

1.3.5Western印迹检测TGF-β1、PPARγ和Caspase-3蛋白水平 细胞裂解后收集总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过PVDF膜进行转膜，分别加入TGF-β1、PPARγ和Caspase-3一抗，室温震荡2 h，4℃孵育过夜，加入二抗，GAPDH作为内参。

1.3.6qPCR检测TGF-β1、PPARγ和Caspase-3的mRNA水平 细胞裂解后收集总mRNA，95℃激活DNA聚合酶5 min后进行PCR，采用40个循环的两步PCR(95℃10 s和60℃30 s)，最终75℃延伸10 min，4℃保持，GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.4统计学处理 采用Prism Graphpad6.0软件，在Turkey多重比较之后，使用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1各组小鼠活动状态、血糖比较 对照组在实验全程毛色光亮，尿量正常，活动正常；模型组在实验全程出现脱毛并且毛发无光泽，明显消瘦，活动减少；Li组和GDF-11组状况有所缓解，Li+ GDF-11组状态和活动情况较Li组和GDF-11组好。对照组PBG〔(6.32±0.95)mmol/L〕明显低于其余各组(P<0.05)；药物干预后Li组、GDF-11组FBG〔(14.75±2.56)mmol/L，(18.56±3.06)mmol/L〕显著低于模型组〔(24.32±3.57)mmol/L〕，并且Li+ GDF-11组FBG〔(10.54±2.13)mmol/L〕显著低于Li组和GDF-11组(P<0.05)。

2.2HE染色结果比较 对照组心肌细胞形态正常，结构完成，排列整齐，染色均匀；模型组心肌细胞肥大，结构模糊、排列紊乱，细胞核固缩；Li组和GDF-11组细胞损伤程度较模型组降低；Li+ GDF-11组的心肌细胞结构接近正常，结构趋紧整齐，细胞肥大显著缓解，见图1。

图1 各组心肌细胞HE染色结果(×400)

2.3Masson染色结果比较 Masson中紫色或深紫色为心肌细胞，蓝绿色为胶原纤维。结果显示对照组细胞核明显，细胞排列整齐，纤维化程度低，胶原纤维阳性染色面积为(3.47±0.35)%，明显低于其余各组(P<0.05)；模型组出现细胞肿胀及结构变化，并且出现大量的纤维，胶原纤维阳性染色面积为(36.76±2.45)%；Li组和GDF-11组纤维化程度显著低于模型组，胶原纤维阳性染色面积分别为(21.42±1.98)%，(20.53±2.25)%；明显低于模型组(P<0.05)；Li+ GDF-11组纤维化程度显著低于Li组和GDF-11组，胶原纤维阳性染色面积为(9.64±1.06)%，明显低于Li组和GDF-11组(P<0.05)，见图2。

图2 各组心肌细胞Masson染色(×400)

2.4各组LDH和CK-MB水平比较 模型组血清LDH和CK-MB显著升高(P<0.05)，Li组和GDF-11组LDH和CK-MB水平显著低于模型组(P<0.05)，而Li+ GDF-11组的LDH和CK-MB水平显著低于Li组和GDF-11组(P<0.05)，见表1。

2.5各组TGF-β1、PPARγ、Caspase-3蛋白和mRNA水平比较 模型组的TGF-β1、Caspase-3表达水平显著升高而PPARγ显著降低(P<0.05)，Li组和GDF-11组TGF-β1和Caspase-3显著低于模型组而PPARγ显著高于模型组(P<0.05)，Li+ GDF-11组TGF-β1和Caspase-3显著低于Li组和GDF-11组而PPARγ显著高于Li组和GDF-11组(P<0.05)，见表2。

表1 各组LDH和CK-MB水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与Li组比较：3)P<0.05；与GDF-11组比较：4)P<0.05；下表同

表2 各组TGF-β1、PPARγ、Caspase-3蛋白和mRNA水平比较

3 讨 论

糖尿病已成为威胁中国人口健康最常见的疾病之一，其中主要为T2DM，占总发病人群的90%以上〔7〕。糖尿病作为一种全身性疾病，会引发多种器官损伤，包括肾损伤、视网膜损伤、心肌损伤等，高糖环境会引起广泛的血管病变，诱发心肌细胞坏死或纤维化导致心肌病，严重者出现心力衰竭甚至死亡，但目前尚无用于治疗糖尿病心肌病的特效药物〔8〕。

有效控制血糖是治疗糖尿病心肌病的基础，Li是一种胰高血糖素样肽(GLP)-1类似物，可以升高葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽(GIP)水平，从而促进胰岛素释放、降低血糖〔9〕。GDF-11具有多种生物学功能，包括调节脂代谢、保护心肌细胞等〔10〕。本研究结果显示，Li和GDF-11可显著减少心肌损伤，保护心肌功能并抑制心肌细胞纤维化，Li和GDF-11联合应用可更显著减少心肌细胞损伤和纤维化，改善心肌酶谱指标。GDF-11可能通过调节脂代谢改善血糖水平，而血糖水平减低也会改善心肌细胞的高糖微环境及氧化应激微环境，从而保护细胞。此外，GDF-11本身也具有一定的器官保护作用。Zhang等〔11〕研究显示GDF-11可改善急性肾脏损伤，也有研究认为GDF-11可改善心肌细胞缺血/再灌注损伤〔12〕。这提示在有Li的条件下，GDF-11可能通过改善血糖水平保护心肌细胞，也可能直接发挥保护心肌细胞的作用。

心肌细胞纤维化是心肌损伤的重要原因之一，TGF-β1被认为是引起器官纤维化的主要影响因素，TGF-β1会上调基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的分泌、抑制其降解，从而引起纤维化〔13〕。高糖环境引起的心肌细胞凋亡增加也是糖尿病心肌病的发病机制之一，Caspase-3是细胞凋亡的主要执行因子〔14〕。PPARγ在糖尿病及相关并发症的发生中均发挥重要作用，PPARγ参与葡萄糖代谢，并参与炎症反应，糖尿病心肌损伤中PPARγ水平显著降低〔15〕。过往研究显示GDF-11可通过改善胰岛β细胞的功能调节血糖〔16〕，这提示GDF-11可能与Li协同作用，进一步降低血糖水平。张昊驹等〔17〕研究认为GDF-11可通过调节TGF-β通路保护神经细胞损伤有保护作用。最新的国内研究显示GDF-11可抑制T2DM心肌细胞凋亡〔18〕。李欢等〔19〕研究认为GDF-11对高糖环境下心肌细胞损伤。最新研究显示PPARγ可抑制T2DM小鼠心肌细胞纤维化〔20〕；和彩玲等〔21〕研究也显示，促进PPARγ相关通路可改善db/db小鼠心肌损伤。这提示，在Li条件下联合GDF-11，可通过上调PPARγ进一步调节血糖，并通过抑制心肌细胞纤维化，同时抑制TGF-β1而保护心肌细胞，抑制心肌细胞凋亡，保护心功能。

综上所述，Li与GDF-11联合使用可进一步控制血糖，通过促进PPARγ和TGF-β1表达调节代谢，抑制心肌细胞纤维化和凋亡，缓解糖尿病心肌细胞损伤，但是关于Li与GDF-11联合使用的效果和安全性还需要进一步研究。