非洲马铃果4 种吲哚类生物碱的体外抗肿瘤效果

白雅竹，郑志忠，陈清智，黄 雯，陈良华，林河通，明艳林,,

(1.厦门华侨亚热带植物引种园／厦门市植物引种检疫与植物源产物重点实验室，福建 厦门 361002；2.福建省亚热带植物研究所／福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006；3.福建农林大学食品科学学院，福建 福州350002；4.福州理工学院文理学院，福建 福州 350506)

非洲马铃果Voacanga africana 又名非洲伏康树、非洲沃坎加树，是一种原产于西非的夹竹桃科植物[1]。非洲马铃果具有悠久的药用历史，主要用于治疗麻风病、痢疾、全身性水肿、小儿惊厥、癫症、利尿剂，也有一定的戒毒药理活性[2—3]。因此，近年来非洲马铃果的应用价值，尤其是其中吲哚类生物碱的应用价值，受到越来越广泛的关注[4—6]。

非洲马铃果含有多种吲哚生物碱[7]，其中含量较高的是长春胺(Vincamine)、冠狗牙花定碱(Coronaridine)、老刺木胺(Voacamine)、伏康京碱(Voacangine)。有研究证实其对肿瘤细胞增殖具有一定的抑制效果，如老刺木胺对肺癌、前列腺癌，伏康京碱对前列腺癌都表现出较好的抑制效果[8—9]；冠狗牙花定碱能抑制人乳腺癌细胞系BCAP 细胞株的增殖；长春胺可作为治疗癌症的临床用药，其作用机制与阳离子相似，能络合多种蛋白质使其形成沉淀，从而达到抗肿瘤的作用[10]。另有研究表明，非洲马铃果树皮水-醇提取物与乌口树属、九节属植物的提取物相比，前者更具显著减缓阿尔兹海默症(AD)的疗效，提取物中含有的生物碱老刺木胺在低剂量下表现出显著的抗氧化性(EC50≤3.4 µmol·L-1)[11]。另有文献指出，非洲马铃果浸提物具有抗分枝杆菌(mycobacterial)和胆碱酯酶(cholinesterase)等活性[12]。

本课题组前期已在厦门成功驯化从非洲加纳引种的非洲马铃果，并对其种子的吲哚类生物碱进行系列研究，从中提取分离鉴定出长春胺、冠狗牙花定碱、老刺木胺和伏康京碱4 种吲哚类生物碱[13—14]。为进一步检测非洲马铃果中这4 种吲哚类生物碱的体外抗肿瘤效果，本研究以细胞形态变化和药物对体外细胞的增殖抑制率为指标，通过方便、简洁、经济的MTT 法、AO/EB 染色法等方法进行研究，为非洲马铃果的深入研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

标准品长春胺、冠狗牙花定碱、老刺木胺、伏康京碱、紫杉醇，购自上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%；噻唑蓝(MTT)、吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)、二甲基亚砜(DMSO)，购自中国食品药品检定研究院。

1.2 供试细胞株

人卵巢癌细胞(SKOV3)、人肝癌细胞(BEL7402、SMMC7721)、正常人肝细胞(Changliver)，均购自中国科学院上海细胞研究所。

1.3 方法

1.3.1 药物配制 将MTT 粉末溶于磷酸缓冲液(PBS)中配置成5 mg·mL-1溶液，用0.22 μm 滤膜过滤除菌，4 ℃避光冷藏。荧光染色液：0.5 g·mL-1AO、0.5 mg·mL-1EB 等体积混匀，用0.22 μm 滤膜过滤除菌，4 ℃避光冷藏。

1.3.2 细胞培养 用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640 培养液于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养四株细胞株，调整细胞状态至对数生长期。取对数生长期细胞，经PBS 冲洗，0.25%胰酶消化制备成单细胞悬液，用血球计数板测定细胞悬液浓度，根据每孔2500 个细胞的量，吸取相应体积细胞悬液，用培养液稀释至相应体积，充分混匀接种于96 孔板；每孔中加入100 µL 稀释好的细胞悬液平铺至孔底，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

1.3.3 MTT 法 测定方法在司金光等[15]方法的基础上作适当调整。取1.3.2 细胞，加入一系列不同浓度梯度的药物培养基200 µL(浓度梯度为0、3.125、6.25、12.5、25、50 µg·mL)继续培养，同时设置空白对照组和阳性对照组。药物处理48 h 后，每孔加20 µL MTT (5 mg·mL-1)后置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，4 h 后终止培养；弃上清液，每孔加入200 µL DMSO 使反应产物溶解，用微孔板快速振荡器振荡10 min；于酶标仪570 nm 处检测吸光度值，并记录统计数据。所有试验重复三次，计算各个孔药物对细胞的增殖抑制率，数据采用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0 软件进行差异显著性分析。

1.3.4 吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)双染 参考文献[16]方法并作适当调整。取1.3.2 备用细胞，加入一系列不同浓度梯度的药物培养基200 µL(浓度梯度为0、12.5、25、37.5、50 µg·mL-1)继续培养，同时设置阴性对照组和阳性对照组。药物处理48 h 后，吸去培养基，加100 µL 荧光染色液避光染色5 min，用PBS清洗2 次，荧光显微镜下观察拍照，随机取5 个视野，分别计数呈绿色荧光和橙红色荧光的细胞，计算细胞凋亡率。凋亡率=橘红色细胞的数量÷视野总细胞数×100%。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

图1 显示，药物处理48 h 后，空白对照组的BEL7402、SMMC7721、Changliver、SKOV3 细胞均单层贴壁生长，细胞数量多且形状饱满，大小均一，胞质丰富，细胞核明显，形态良好。相比于空白对照组，12.5 μg·mL-1老刺木胺作用的四株细胞株细胞形态发生明显变化，体积缩小，细胞皱缩变圆，部分细胞间连接变小，贴壁不紧，出现脱落现象，与2 μg·mL-1紫杉醇阳性对照组的细胞形态特征及凋亡相似。50 μg·mL-1伏康京碱处理后，BEL7402、Changliver 细胞也有同样的变化，并且出现少量大小不等的细胞碎片，但SKOV3、SMMC7721 细胞形态变化不明显。而经50 μg·mL-1长春胺和冠狗牙花定碱处理的四株细胞未见显著变化。

图1 四种药物对四株细胞株作用48 h 后的细胞形态Fig.1 Cell morphology of four cell lines treated with four drugs for 48 h

2.2 MTT 结果

不同类型吲哚类生物碱在体外对四株细胞株均有不同程度的抑制作用。老刺木胺对四株细胞株的增长抑制效果如图2: A 所示，对数生长期的不同细胞经不同浓度药物处理后，细胞增殖抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系。当药物浓度达50 μg·mL-1时，对四株细胞的增殖抑制率达96%以上。伏康京碱对四株细胞株的增长抑制效果如图2: B 所示，低浓度时，该生物碱对四株细胞株未见明显的细胞毒作用，浓度达到50 µg·mL-1时，对BEL7402 和Changliver 细胞株的增殖抑制率达78%以上。长春胺对各细胞株没有明显的细胞毒作用(图2: C)。冠狗牙花定碱作用于SKOV3 和BEL7402 细胞株未见明显细胞毒作用；其浓度达50 µg·mL-1时对SMM7721 和Changliver 细胞株具低细胞毒作用，抑制率分别为38.0%和55.2%(图2: D)。由此可知，四种吲哚类生物碱对各肿瘤细胞具有不同的抑制效果，这种差异性可能与它们在上述浓度条件下各自的活性有关[17]。

图2 四种吲哚生物碱对癌细胞的体外增殖抑制效果(48 h)Fig. 2 Inhibitory effects of indole alkaloids on proliferation of cancer cells in vitro for 48 h A.老刺木胺；B.伏康京碱；C.长春胺；D.冠狗牙花定碱

2.3 AO/EB 法染色结果

AO 能够穿过正常细胞膜使DNA 染色而使细胞核呈现明亮的绿色荧光，EB 只能穿过细胞膜受损的细胞使DNA 染色而使细胞核呈现橘红色荧光。因此，AO/EB 双染后正常细胞呈现绿色荧光，凋亡细胞呈现橘红色荧光。

AO/EB 染色凋亡分析如图3 所示。对照组细胞中心的核染色质均呈现均匀、黄绿色的荧光，未见凋亡细胞；老刺木胺作用组在所示浓度下，细胞数量明显减少，呈现黄绿色荧光，并且浓聚成颗粒状，位于细胞的一侧，说明细胞发生凋亡[16]，表明该药物对四株细胞均有较强的毒性作用。在图示浓度下，伏康京碱作用BEL7402、Changliver 部分细胞核显示橘黄色或红色浓集荧光或荧光减弱，呈现一定的细胞凋亡形态。但长春胺组和冠狗牙花定碱组未见明显的细胞凋亡现象。

凋亡率统计显示，12.5 μg·mL-1老刺木胺对四株细胞的凋亡诱导作用最大，接近100%；50 μg·mL-1长春胺和冠狗牙花定碱对细胞株的诱导凋亡率低；50 μg·mL-1伏康京碱对BEL7402、Changliver 具有一定诱导凋亡率，而对另外两株细胞无明显的诱导作用(图4)。

图3 荧光显微镜下四种吲哚类生物碱对四株细胞的作用形态Fig. 3 The morphology of four cell lines induced by four indole alkaloids under a fluorescence microscope

3 讨论

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的常见病。肿瘤细胞特殊的生理学结构及其不定向的转移，使得传统的手术、化疗等治疗方法不能取得令人满意的疗效。找寻高疗效、低毒性乃至无毒性的化合物一直都是肿瘤药物研发的主要目标。非洲马铃果作为一种具有长久药用历史的热带植物，自20 世纪50 年代以来，已有不少国内外研究者对其生物活性成分进行开发利用，就目前看来，其内除含有生物碱之外，也有不少的挥发油类化合物、黄酮类等其他化学成分[18]。

本文比较了非洲马铃果中4 种吲哚类生物碱的体外抗肿瘤效果。MTT 方法结果显示，50 μg·mL-1老刺木胺对四株肿瘤细胞均有超过95%的抑制率；而相同浓度的伏康京碱仅对Changliver 和BEL7402 有超过78%的抑制率；长春胺和冠狗牙花定碱对肿瘤细胞的增殖抑制效果不明显。经AO/EB 双染色显示，4 种生物碱中仅有老刺木胺对肿瘤细胞具有显著的抑制效果，能使细胞核出现浓聚和偏移现象。老刺木胺对正常肝细胞Changliver 同样具有较强的抑制作用，使得老刺木胺在抗肿瘤药物制备应用中受到很大局限，因此可以考虑对其化学结构进行过修饰，从而达到降低对正常细胞的毒副作用，类似紫杉醇和多烯紫杉醇。本研究仅局限在非洲马铃果中吲哚类生物碱的体外抗肿瘤活性上，其抗肿瘤机理有待进一步研究。

图4 四种吲哚类生物碱对四株细胞诱导凋亡率Fig. 4 The induction rate of apoptosis by four indole alkaloids in four cell lines