广西金线莲不同移栽月龄生物学性状及活性成分含量研究

李惠华，曾碧玉

(福建省亚热带植物研究所／福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006)

金线莲Anoectochilus roxburghii 又称金线兰，系兰科开唇兰属多年生草本植物，《中国植物志》记载该属有20 种和2 变种[1]。金线莲是民间珍稀药草，广泛用于治疗炎症和热症[2]。研究表明，金线莲富含多糖、氨基酸、微量元素、强心苷类、有机酸、甾体化合物、黄酮类化合物、生物碱等成分，其中多糖、多酚、黄酮为其主要活性成分，是评价金线莲品质的主要指标，具有抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、增强免疫等广泛生物活性[3—4]。不同地理种源金线莲的活性成分含量存在差异，林丽清等[5]测得广西金线莲粗多糖生药含量为37.45%，多糖含量在金线莲中较高[6]。广西金线莲叶面大、植株大，是主要的栽培销售种源。

目前，金线莲的研究多集中于组织培养技术、栽培管理技术、化学成分及其药理作用 。采收期是果蔬以及药材品质的重要影响因子[8]。然而，目前金线莲的采收尚无标准可依。市面上不同移栽阶段的金线莲均有出售，但多以室外移栽90～120 d 或180 d 的金线莲居多。可见，系统研究金线莲不同移栽阶段的生物量及活性成分的变化规律具有重要意义。至今，金线莲不同采收时期生物量及活性成分的系统研究甚少[9—11]。本研究选用市场销售较多的广西金线莲为研究对象，对其不同移栽阶段的生物学性状、生物产量及主要活性成分多糖、多酚、黄酮含量进行评估，以期为金线莲活性成分开发利用、采收适期的确定以及不同种源金线莲的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为广西金线莲(图1)，经林文革高级工程师鉴定。移栽种植实验在厦门地缘生物科技有限公司(福建厦门)大棚内进行。地处118°01′E，24°46′N，属亚热带海洋性气候，年均温20.5 ℃，年均降雨量1234 mm。大棚为简易大棚，采用聚乙烯薄膜，外层加盖遮阳网，光照3000～3500 lx，温度控制在15～30 ℃，相对湿度75%～85%。

图1 广西金线莲Fig. 1 Anoectochilus roxburghii from Guangxi

1.2 试剂与仪器

没食子酸标准品及福林酚试剂(美国Sigma 公司)，芦丁标准品(天津一方科技有限公司)；95%乙醇、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、氢氧化钠、酒石酸钾钠及亚硫酸钠购自国药试剂公司；分析级粉碎机(A11)(德国IKA 集团)，紫外/可见光光谱仪(Lambda 25)(美国PERKINELMER 股份有限公司)，恒温培养振摇器(ZWYR-2102)(上海智诚分析仪器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 生物学性状调查 移栽苗(组织培养满180 d)由厦门地缘生物科技有限公司提供。移栽培养钵口径8 cm，培养基质为植物腐殖质40%、泥炭土25%、珍珠岩25%、细沙10%，每钵种植1 株金线莲。常规栽培管理。

定植后，采收4～9 月龄金线莲。采收后，随机挑选15 株进行生物学性状及生物量调查。软尺测量茎高(顶芽抽出处至茎基部长度)，数显游标卡尺测量茎粗(茎最粗处直径大小)。选取植株最大展开叶片，用软尺测量叶长及叶宽。计算植株叶片数，并测定单株鲜重及干重。单株鲜重为单株材料清洗干净并擦拭干水分后称重所得；单株干重为测定鲜重后于50 ℃烘箱烘干至恒重。

1.3.2 活性成分提取 金线莲采收后，用流水冲洗蒸馏水润洗，50 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎机粉碎并过40 目筛，得到干燥粉末，密封-80℃贮存备用。

称取500 mg 金线莲干燥粉末，按1:60(W/V)料液比加入60%乙醇溶液，于摇床中120 r·min-1、25 ℃振摇48 h，过滤取滤液并定容，供总多酚及总黄酮含量测定。滤渣进一步按1:60(W/V)料液比加入蒸馏水，60 ℃水浴1.5 h，过滤，取滤液并定容，供总糖与还原糖含量测定。

1.3.3 活性成分测定

1.3.3.1 多糖含量测定 多糖含量根据公式多糖含量(mg·g-1DW) = 总糖含量-还原糖含量计算。总糖与还原糖含量测定采用苯酚-硫酸法与3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定，参考曾碧玉等[12]方法。

1.3.3.2 总多酚含量测定 参照Zuo 等[13]所述方法并加以修改。

标准没食子酸溶液配制(5.00 mg·mL-1)：精确称取没食子酸500 mg，蒸馏水溶解并定容至100 mL，摇匀。

标准曲线制作：将上述标准溶液稀释100 倍后得到50 μg·mL-1没食子酸溶液。在各比色管中，分别吸入0、100、200、300、400、500、600、700、800 μL 没食子酸溶液，补足蒸馏水至2.00 mL，混匀。每管再分别加入1.00 mL 福林酚试剂，混匀后反应4 min。各管中再分别加入1.00 mL Na2CO3溶液(10%)，避光室温条件下静置2 h。以蒸馏水为参比，于765 nm 波长处测定吸光值。每管各测3 次。标准曲线方程：y = 0.0246 x，R2= 0.9980。其中，x 为没食子酸含量(μg)，y 为吸光度值。

样品含量测定：取1.00 mL 样品溶液，同上法操作，测定吸光度值，按所得标准曲线方程计算样品总多酚含量(mg·g-1DW)。

1.3.3.3 总黄酮含量测定 参照Sheng 等[14]方法并略加修改。

标准芦丁溶液配制(100 μg·mL-1)：精确称取10 mg 芦丁(105 ℃干燥至恒重)，加适量60%乙醇，水浴加热溶解，待冷却后，用60%乙醇定容至100 mL，摇匀。

标准曲线制作：于具塞试管中，分别加入0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 芦丁标准液，分别补加60%乙醇至5.00 mL，混匀；分别加300 μL NaNO2溶液(5%)，混匀反应6 min；再分别添加300 μL Al(NO3)3溶液(10%)，混匀静置反应6 min；然后，分别加4.00 mL NaOH 溶液(1 mol·L-1)，混匀；最后，分别加400 μL 60%乙醇溶液，摇匀。放置10 min 后，以60%乙醇为参比，于510 nm 波长处测定吸光值。每管均测3 次。标准曲线方程：y=1.8655x，R2=0.9999。其中，x 为芦丁含量(mg)，y 为吸光度值。

样品含量测定：准确吸取1.00 mL 样品溶液，操作步骤同上，测定吸光度值，按上述方程计算样品总黄酮含量(mg·g-1DW)。

1.4 数据分析

生物学性状与活性成分测定数据分别为15 次与3 次平行实验结果，数据均表示为平均值±标准误。方差分析采用SPSS 11.5 软件的One-Way ANOVA 分析。

2 结果与分析

2.1 不同移栽月龄广西金线莲生物学性状

广西金线莲不同移栽月龄生物学性状如表1。4～9 月龄叶数3.1～4.1 片；最大叶叶长3.91～4.45 cm、叶宽2.67～3.00 cm；茎高8.81～10.32 cm，茎粗3.21～3.42 mm；根数1.5～2.3，最长根长2.82～3.93 cm。

表1 广西金线莲不同移栽月龄生物学性状Table 1 Biological characters of Anoectochilus roxburghii from Guangxi at different months after transplantation

广西金线莲不同移栽月龄生物产量见表2。随着移栽时间的延长，单株鲜重及干重呈曲折上升趋势。9 月龄鲜重及干重最高，分别为2.470 g 及0.2033 g。不同移栽月龄折干率也有所差异，9 月龄折干率最小，为12.52%。综合比较，9 月龄生物产量最高。

表2 广西金线莲不同移栽月龄生物产量Table 2 Biomass of Anoectochilus roxburghii from Guangxi at different months after transplantation

2.2 不同移栽月龄多糖含量的变化

广西金线莲移栽后，4～9 月龄多糖含量呈先下降后上升的趋势(图2: A)。4 月龄多糖含量最高，为10.46 mg·g-1；随后，多糖含量随着移栽时间的延长而下降，7 月龄最低；到9 月龄时，多糖含量升至10.13 mg·g-1，与4 月龄相比无显著差异。

2.3 不同移栽月龄多酚含量的变化

广西金线莲移栽4～6 个月，多酚含量不断上升，6 月龄多酚含量最高，为9.49 mg·g-1；随后缓慢下降后又上升，9 月龄多酚含量为9.41 mg·g-1，与6 月龄无显著差异(图2: B)。

2.4 不同移栽月龄总黄酮含量的变化

广西金线莲不同移栽月龄的总黄酮含量如图2: C 所示。随着移栽时间延长，黄酮含量先降后升再趋于平稳。5 月龄黄酮含量最低；6 月龄黄酮含量最高(3.80 mg·g-1)，但与7～9 月龄黄酮含量无显著差异。

图 2 广西金线莲移栽不同月龄多糖、多酚、黄酮含量动态变化Fig. 2 Dynamic changes of polyphenos, polysaccharides and flavonoids of Anoectochilus roxburghii from Guangxi at different months after transplantation

3 讨论

多糖、多酚及黄酮是金线莲的重要活性成分，其含量是评价金线莲品质的重要指标。前人研究发现，金线莲在移栽满120 d 时总黄酮含量高于移栽0 d 的植株；而多糖含量则相反，移栽0 d 的植株较高[8,15—16]。本研究中，广西金线莲总黄酮6 月龄最高，但与7～9 月龄无显著差异；多糖含量变化趋势为先下降后上升，近似“V”字型，4 月龄含量最高，7 月龄最低，9 月龄与4 月龄无显著差异；此外，总多酚含量6 月龄最高。因此，若以收获总多酚或总黄酮为目的，可选用6 月龄移栽苗；但若以收获多糖为目的，可直接选用4 月龄移栽苗。生物量是金线莲经济效益的重要指标之一。本研究中，广西金线莲生物量以9 月龄最高。随着不同移栽月龄的增加，人工栽培阶段的成本和病虫害危害的可能性增加，结合生物量、多糖、多酚及黄酮的变化趋势，认为移栽6 个月为广西金线莲最佳采收期。