长链非编码RNA ZEB1-AS1在儿童脑肿瘤中表达及对化疗药物敏感性影响的实验研究 *

2019-10-16 11:00
现代检验医学杂志 2019年5期
关键词:胶质瘤敏感性耐药

曹 玲

(榆林市第一医院新生儿病区,陕西榆林 719000)

儿童恶性肿瘤严重危害儿童健康[1-2],全球儿童恶性肿瘤发病出现逐年递增的恶性趋势[3-4],死亡率居高不下[5],我国儿童恶性肿瘤防治与西方发达国家相比有显著差距[6-8]。儿童恶性肿瘤给家庭及社会带来了巨大的伤害和经济负担[9-11]。研究发现,原发性儿童脑肿瘤是儿童恶性肿瘤致死的主要原因[12-13],儿童脑肿瘤发病高峰期为4~9岁,其诊治与成人肿瘤具有较大差异[12]。且近年来发现在患儿化疗过程中出现耐药的趋势,故亟待寻找新的肿瘤标志物,特别是耐药相关的肿瘤标志物[14],探索儿童脑肿瘤耐药的新机制对儿童脑肿瘤的治疗和预后有重要意义。本研究通过前期研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA) lnc-ZEB1-AS1 (Zinc finger E-box Binding homeobox 1 Antisense RNA 1,ZEB1-AS1)在儿童脑肿瘤中高表达,本研究将对其在儿童脑肿瘤耐药过程中所起作用进行以下研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究所用到的18例儿童脑肿瘤组织标本于2016年1月~2018年9月收集于榆林市第一医院,其中男性11例,女性7例,平均年龄4.1±2.2岁。患者之间不存在亲缘关系。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂:PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser购买自TAKARA公司(日本),DEPC水(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)、lipofectamine 3000转染试剂、TRIzol试剂、顺铂和5-FU均购买自Invitrogen(美国),CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂购买自APExBIO公司(美国)。

1.2.2 仪器:ABI 7500 PCR仪购买自ABI公司(美国)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及转染:人CHG-5细胞购买于中国科学院上海细胞库,常规培养所用培养基采用含10 ml/dl FBS+1 ml/dl双抗的1640培养液,5%(v/v)CO2,37℃,饱和湿度下培养。

lnc-ZEB1-AS1干扰及其对照DEPC水溶液根据上海生工操作手册说明配置。细胞接种24 h,细胞汇合度达70%~80%后进行转染。转染试剂采用lipofectamine 3000,细胞转染实验操作步骤按life technologies公司说明书进行,转染8 h后换液,待细胞达到对数生长期后进行下一步实验。

1.3.2 CCK-8实验:取上述转染后处于对数生长期的CHG-5细胞,常规消化制成细胞悬液后按200 cell/well浓度接种于96孔板中,每组细胞设置5个平行孔,并按检测时间设置(0,24,48,72,96 h)共计5个平行96孔板。常规进行细胞培养,检测前使用PBS清洗细胞3次后加入新鲜培养液,并按要求加入CCK-8试剂,检测其450 nm波长下的吸光度值,并比较各组差异。

1.3.3 化疗药物敏感性实验:取转染后处于对数生长期细胞用于此项实验。本实验采用加入化疗药物(顺铂和5-FU)后检测各组细胞生长抑制情况差异来分析lnc-ZEB1-AS1不同表达水平下对化疗药物敏感性的差异。

实验中,取胰蛋白酶消化重悬后的细胞计数,接种于96孔培养板中,每孔接种2×104个细胞,每组设置5个平行孔;按对数浓度梯度设置化疗药物(5-FU,顺铂)的浓度梯度加药,常规培养24 h后PBS清洗96孔培养板,加入含20 ml/dl CCK-8试剂的培养液,2 h后在450 nm波长下检测其吸光度值,吸光度值愈高则表示孔内细胞越多。

1.3.4 Transwell实验:取上述转染后处于对数生长期的细胞,常规消化处理成细胞悬液。按2×104cell/well接种于小室中,小室上层使用无血清高糖培养液,下层使用含20 ml/dl胎牛血清的高糖培养基进行培养,48 h后使用多聚甲醛固定后进行结晶紫染色,并使用显微镜拍照计数。

Transwell 迁移实验和侵袭实验步骤相同,仅侵袭实验所使用的小室为预先铺设基质胶。

1.4 统计学分析 采用配对t检验分析癌组织和对应癌旁正常组织中lncRNA表达水平的差异。使用独立t检验分析细胞迁移和侵袭能力差异;采用重复测量的方差分析方法分析细胞增殖能力的差异(CCK-8实验及化疗药物敏感性实验)。统计过程使用实验SPSS19.0软件运行,所有检验均为双侧检验,α=0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

图1 ZEB1-AS1在儿童脑肿瘤中高表达

2.2 干扰lnc-ZEB1-AS1抑制肿瘤细胞增殖 本研究通过CCK-8实验验证了干扰lnc-ZEB1-AS1后对CHG-5细胞增殖能力的影响。通过重复测量的方差分析,结果显示:当细胞增殖48 h以后,干扰组细胞增殖速度明显较对照细胞低。

转染后0,24,48,72和96h分别在450 nm下的吸光度值(A值),分别为干扰组vs对照组(时间,P干扰vs对照):0.337±0.009 vs 0.339±0.029(0 h,P>0.05),0.350±0.017 vs 0.360±0.029(24 h,P>0.05),0.487±0.040 vs 0.545±0.028(48 h,P=0.044),0.548±0.061 vs 0.678±0.055(72 h,P=0.013)和0.718±0.035 vs 0.899±0.073(96 h,P=0.002),见图2。通过以上数据可见在细胞生长达到平台期以前,干扰ZEB1-AS1能够明显抑制CHG-5细胞的增殖。

(*P<0.05,**P<0.01)

2.3 干扰lnc-ZEB1-AS1增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性 通过改进CCK-8实验验证了干扰lnc-ZEB1-AS1后宫颈癌细胞对常见化疗药物5-FU和顺铂敏感度的影响。

其中,干扰组对5-FU的IC50为14.72±3.89 μmol/L,对照组对5-FU的IC50为3.15±0.89 μmol/L(P<0.01);干扰组对顺铂的IC50为53.26±6.36 μmol/L,对照组对顺铂的IC50为8.23±1.65 μmol/L(P<0.01)。两种化疗药物处理后细胞的存活曲线见图3。两种药物实验结果均显示:过表达组细胞对5-FU及顺铂的敏感度降低,提示干扰ZEB1-AS1能够增加CHG-5细胞对5-FU及顺铂的敏感度。

(*P<0.05,** P<0.01)

2.4 干扰lnc-ZEB1-AS1的表达后将抑制CHG-5细胞迁移和侵袭 本研究通过Transwell迁移实验验证了干扰lnc-ZEB1-AS1后对CHG-5细胞迁移能力的影响。通过吉母萨染色后显微镜下拍照(200×)计数后分析发现:干扰组CHG-5细胞迁移能力明显较对照细胞减少:干扰vs对照:93.4±6.7 vs 51.2±9.4,P<0.001,见图4A,B。本研究通过Transwell迁移实验验证了干扰lnc-ZEB1-AS1后对CHG-5细胞侵袭能力的影响。通过吉母萨染色后显微镜下拍照(200×)计数后分析发现:干扰组CHG-5细胞侵袭能力明显较对照细胞减少:干扰vs对照:64.1±6.3 vs 31.1±4.2,P<0.01,见图4C,D。

(A:迁移照片200×;B:迁移数据统计;C:侵袭照片200×;D:侵袭数据统计)

3 讨论

我国儿童恶性肿瘤疾病负担严重,且发病率逐年上升[11-13],给国家和患者家庭都带来了沉重的经济负担[9]。儿童恶性肿瘤发病率主要在4~9岁[12],其主要原因是儿童神经系统尚未发育完善,容易忽略疾病早期症状[15-16],儿童实体肿瘤发病约占所有儿童恶性肿瘤的2/5,稍低于白血病和淋巴瘤,其中儿童脑肿瘤主要为原发性肿瘤,以先天性肿瘤和胶质瘤最为常见[17]。目前对于儿童实体肿瘤的治疗以手术为主,放化疗为辅,但是由于肿瘤确诊时有较多病例已发展为终末期,已不适合手术治疗的情况下化疗出现耐药[18-19],而当前对儿童脑肿瘤化疗耐药机制尚未有深入研究。

本研究发现在敲低lnc-ZEB1-AS1后CHG-5细胞增殖受到抑制,且迁移和侵袭能力也同样受到抑制;研究者通过检测干扰lnc-ZEB1-AS1后CHG-5细胞对5-FU和顺铂的耐药情况,发现敲低lnc-ZEB1-AS1后CHG-5细胞对上述两种化疗药物的敏感性较对照组明显增加。上述研究结果与LI等[20-21]在膀胱癌中的研究结果类似,其研究发现lnc-ZEB1-AS1在膀胱癌中表达上调,且对化疗敏感性降低。CHENG等[22-23]研究发现lnc-ZEB1-AS1通过和ZEB1基因相互作用,促进卵巢癌细胞侵袭和间充质上皮细胞转化。FU等[24-26]几个研究均发现lnc-ZEB1-AS1在结直肠癌中高表达,且与结直肠癌患者不良预后相关。JIN等[27]报道lnc-ZEB1-AS1高表达与非小细胞肺癌患者不良预后相关,且能够促进肺癌细胞迁移并影响其细胞周期。另有研究报道lnc-ZEB1-AS1与肝癌、胃癌、骨肉瘤等[28-32]多种肿瘤相关。

在脑肿瘤中,LU等[33]研究发现lnc-ZEB1-AS1能够促进神经胶质瘤细胞癌变,与神经胶质瘤患者不良预后相关;MENG等[34]研究发现lnc-ZEB1-AS1通过调控miR-200c/141-ZEB1轴导致神经胶质瘤发病;WEI等[35]发现lnc-ZEB1-AS1通过与miR-577作用促进神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和转移。以上研究均表明lnc-ZEB1-AS1在神经胶质瘤等多种肿瘤中发挥促癌基因的作用,但是目前尚未见到其在儿童脑肿瘤耐药机制上的研究。本研究发现干扰lnc-ZEB1-AS1后,神经胶质瘤细胞对化疗药物敏感性升高。

综上所述,本研究发现lnc-ZEB1-AS1在儿童脑肿瘤中高表达,且通过细胞生物学实验发现其低表达后对化疗药物的敏感性增加,但是尚未对lnc-ZEB1-AS1介导儿童脑肿瘤耐药的分子机制进行进一步研究,是本研究的不足之处。

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