三代EGFR-TKI奥希替尼(AZD9291)耐药细胞系建立及耐药标志预测分析 *

苗留飞，杨 阳，余柏增，张家勋，李晓军

(南京大学医学院附属金陵医院/东部战区总医院中心实验科，南京 210002)

肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位[1]，约50%的亚洲非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者存在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突变[2]，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)已经成为EGFR敏感突变阳性晚期NSCLC患者的一线治疗药物[3]。长期使用EGFR-TKI治疗不可避免地产生获得性耐药[4-5]。第三代EGFR-TKI奥希替尼(osimertinib，AZD9291)针对EGFR T790M突变，被广泛用于一代EGFR-TKI获得性耐药后替代治疗[6]。AZD9291耐药机制复杂多样，未被完全明确，给临床AZD9291耐药后治疗策略的选择带来困难。本研究通过自主构建AZD9291耐药细胞系PC9-OR，生物信息学挖掘GEO数据库耐药细胞表达谱数据，筛选差异表达基因，构建耐药预测模型并评估其诊断效能。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 PC9细胞系(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)培养于含10 ml/dl胎牛血清(Gibco)RPMI 1640培养基(Gibco)中，置于37℃，5%(v/v)CO2、饱和湿度培养箱进行培养。

1.2 试剂和仪器 奥希替尼(AZD9291)购自Selleck公司；DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；RNA提取(RNA isoplus)、反转录、荧光定量(SYBR Green)试剂盒购自Takara公司；荧光定量PCR仪(ABI)；引物合成及Sanger测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 PC9细胞系验证：天根细胞DNA提取试剂盒提取PC9细胞DNA，经相应18，19，20，21号外显子引物PCR扩增后进行sanger测序，与参考序列比对。

1.3.2 奥希替尼耐药PC9细胞系构建及细胞毒性实验：奥希替尼起始浓度10 nmol/L，视细胞生长状况隔两周将药物浓度翻倍，约5个月加至1 μmol/L，1 μmol/L维持两周，CCK8检测细胞IC50并计算耐药指数RI(耐药细胞IC50/亲本细胞IC50)[7]。

1.3.3 利用qPCR技术检测PC9和PC9-OR：首先RNAisoplus提取细胞总RNA，反转录成cDNA后进行qPCR。以GAPDH为内参，利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.3.4 数据挖掘及可能耐药基因检测：三代EGFR-TKI耐药细胞表达谱芯片数据GSE106765[8]，GSE75602[9]和测序数据GSE103350。所有数据进行RMA标准化处理后经过log2对数转化。分别用limma包和DEseq2包分析差异表达基因，FC>2倍且P<0.05被认为差异具有统计学意义。

1.3.5 耐药signature的构建：利用logistics回归构建多个基因联合诊断的回归模型，ROC曲线在独立数据集GSE34228中评价模型诊断效能。

1.4 统计学分析 芯片和测序数据用R软件分析处理，ROC曲线使用STATA软件绘制，两组之间计量数据使用studentttest检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PC9细胞系鉴定 测序显示，PC9细胞EGFR基因19号外显子5个氨基酸缺失(ΔELREA)。

2.2 三代EGFR-TKI耐药细胞系构建 通过浓度梯度递增加药，构建了对奥希替尼耐药的细胞系PC9-OR，见图1。PC9的IC50=0.006 1 μmol/L，PC9-OR的IC50>10 μmol/L，耐药指数大于1 639。

图1 PC9和PC9-OR耐药细胞的IC50

2.3 差异表达基因的筛选与qPCR验证 利用GEO数据库(GSE106765，GSE75602和GSE103350)，分析多个耐AZD9291细胞株差异基因，分别有47，372，45个表达上调基因。其中共同表达上调的3个，分别为MRAS，CTGF和ANKRD1。对在2个或者2个以上细胞数据中表达升高的基因进行荧光定量PCR验证，结果显示CTGF，MRAS，ANKRD1，IL32，DUSP1，CLIC4，PPBP和MCAM的表达上调显著，见图2A。同时已知的AZD9291耐药基因FGFR1，FGF2和MET在我们构建的PC-OR中表达也升高，见图2B。

A：不同数据集共同高表达基因RNA表达量；B：已知耐药基因的RNA表达量。

(**P<0.01；***P<0.001)

图2PC-9和PC9-OR细胞基因表达

2.4 EGFR耐药性预测 独立数据集GSE34228中用Logistic回归构建不同高表达基因的耐药预测模型，结果显示，MRAS，MET，ANKRD1，MCAM和FGFR1具有较好的诊断效能，联合诊断ROC曲线下面积达0.982 2，见图3。

图3 差异表达基因的ROC曲线

3 讨论

长期使用AZD9291会出现肿瘤的获得性耐药，表现为出现EGFR下游信号分子RAS或BRAF激活突变[10-11]，Her-2及MET扩增旁路激活EGFR下游受体酪氨酸激酶[12]，Aurora kinase[13]，PIK3C[14]，FGF2-FGFR1自分泌环[15]以及转化为小细胞肺癌[16]。

我们自主构建了三代EGFR-TKI奥希替尼耐药细胞系PC9-OR。为了获得非小细胞肺癌耐药的共同基因特征，我们运用了多个AZD9291耐药细胞的高通量测序及芯片数据整合分析[7-8]。在PC9-OR上进行了验证，获得了11个AZD9291耐药细胞中高表达的基因。利用独立的EGFR-TKI耐药细胞株，我们发现ANKRD1，MET，MRAS，MCAM和TGFR1等5个高表达基因对三代EGFR-TKI耐药具有较好地诊断效能，联合诊断效能0.982 2。这五个基因可以作为EGFR-TKI耐药的标志用于预测EGFR-TKI耐药。

同时这些基因可以为下一步细胞学实验验证耐药机制提供新的思路。MET是一个编码酪氨酸激酶受体的原癌基因，其配体是肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor，HGF)，HGF/MET信号通路在组织损伤修复、促有丝分裂等过程中发挥重要作用，MET扩增激活了细胞内如PI3K-Akt，Ras-MAPK，STAT3等多种信号通路，可以介导对一代、三代EGFR-TKI耐药[17]。MRAS编码一个小GTPase的ras家族成员，这些膜相关蛋白在包括细胞生长和分化在内的多个过程中作为信号转导物发挥作用，而ras信号的失调与许多类型的癌症有关，其编码蛋白可能在TNFα和MAPK信号通路中起作用[18]。锚蛋白重复域1(ankyrin repeat domain 1，ANKRD1)被报道与ZEB1共同参与了奥希替尼耐药NSCLC细胞系PC9-OR，HCC827-OR细胞的EMT演变，还可能通过促进细胞bcl-2表达起到抗凋亡作用[9]。黑色素瘤细胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule，MCAM)又称CD146，与部分细胞黏附分子有同源性，介导细胞黏附、维持细胞形态及调控细胞增殖、运动等。有报道MCAM通过上调干性相关基因、抑制β-catenin表达、促进细胞迁移和侵袭介导了一代EGFR-TKI获得性耐药[19]。可以激活下游很多信号级联转导分子，调控细胞发生与增殖等多种生物学过程，FGFR1扩增曾被报道介导了一例患者的奥希替尼获得性耐药[15]。

建立EGFR-TKI耐药基因标志可以为预测肿瘤耐药的发生提供依据，同时也可以为后期建立EGFR-TKI早期血清学标志奠定基础。目前EGFR-TKI耐药预测表型多基于体外耐药细胞系[20]，由于有限的三代EGFR-TKI临床样本的数据，给耐药机制和耐药表型标志物的建立带来了困难。本研究建立EGFR -TKI的耐药预测基因集，结果显示高表达耐药基因特征的细胞具有EGFR-TKI抗性，能够对EGFR-TKI耐药有一定的提示作用。同时，肿瘤在体内的状态具有更复杂的表型和局部微环境，尽管我们在多株EGFR-TKI耐药细胞株上都获得了验证，但是由于肿瘤的异质性，我们需要进一步在肿瘤患者体内进行相关的验证。