乌鲁木齐汉族妇女亚甲基四氢叶酸还原酶基因变异与血清叶酸和同型半胱氨酸水平的相关性研究 *

张 燕，王伟红，郝万鹏

(1.乌鲁木齐市第一人民医院检验科，乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐市温泉康复医院，乌鲁木齐 830017)

亚甲基四氢叶酸还原酶全称为5.10-亚甲基四氨叶酸还原酸酶(methylenetetrarydrofo-late reductase，MTHFR)，为叶酸(folic)与同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢通路的关键酶，从而维持了血液中Hcy的浓度；另一方面还参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA，RNA蛋白质的甲基化。MTHFR基因位点发生突变，其变异直接影响酶的活性，引起MTHFR酶活性下降，使Hcy向蛋氨酸的转化发生障碍，引起高同型半胱氨酸血症。影响叶酸的整个代谢过程。有学者研究报道，rs1801133(C677T)这个位点与人类疾病的关联更为紧密，这个位点的多态性在不同人群、不同种族中的分布不一致，在全球范围内的变异频率较高，不同地区有较大差异[1-2]。还有文献报道，异常的叶酸代谢可能导致引起高同型半胱氨酸血症，从而导致多种疾病的发生。产生胎盘毒性等机制导致不良妊娠结局(包括自然流产、早产、异位妊娠、胚胎停育、死胎、先天性心脏病、出生缺陷等)的发生。MTHFR基因C677T多态性位点可能是导致不良妊娠高风险的因素之一[3]。据此，本文利用2018年1月～2019年1月来本院进行孕前或孕期体检的MTHFR位点TT基因型的育龄妇女作为观察组研究对象。另选择非MTHFR位点TT基因型者的健康育龄妇女作为对照组研究对象，两组研究对象皆在我院产科分娩。研究两组不良妊娠结局的发生频率，同时分析叶酸与Hcy两者浓度的变化及相关性，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年1月～2019年1月期间在我院进行孕前与孕期检查且在我院分娩的汉族育龄女性。选择观察组，排除不符合要求、籍贯非本市者，共110例，年龄在20～35岁，平均年龄30.5±5.1岁。全部为MTHFR C677T位点TT基因型。对照组纳入标准：非MTHFRC677T位点TT基因型者，生育史正常，无不良妊娠史及家族性遗传病史，无甲亢及糖尿病等内分泌病史，新生儿健康。年龄在19～34岁之间，平均年龄29.1±4.1岁，在年龄、血压、BMI方面，差异无统计学意义(P>0．05)。在我院进行孕前与孕期检查且在我院分娩的汉族育龄女性118例。进行回顾性研究。

1.2 仪器与试剂 基因测定：PCR基因扩增仪(苏州市天隆科技有限公司)。MTHFRC677T基因检测试剂盒(西安金磁纳米生物技术有限公司)。Hcy测定：全自动生化分析仪(罗氏公司7600型)，试剂盒为北京九强科技有限公司产品。叶酸测定：化学发光分析仪(罗氏公司E602型)，试剂盒为罗氏公司配套产品，批号332978。

1.3 方法

1.3.1 样品收集：对所有受检查者空腹抽取外用静脉血2 ml于EDTA抗凝管，另取5 ml于分离胶采血管。

1.3.2 MTHFRC677T基因检测：检测项目为MTHFRC677T位点。样品为收集的2 ml EDTA抗凝血，通过侧向层析技术实现MTHFRC677T基因多态性的检测。具体参数及操作方法参照PCR扩增仪及试剂盒说明书进行。

1.3.3 血清Hcy测定：将5 ml分离胶采血管离心分离血清，仪器使用罗氏7600全自动生化分析，试剂使用北京九强循环法试剂盒，按照仪器与试剂说明书操作步骤进行Hcy检测。Hcy正常参考范围为5～15 μmol/L。

1.3.4 血清叶酸测定：将测定Hcy分离的血清，使用罗氏E602全自动化学发光分析仪，厂家配套试剂盒(批氏E602号332978)，按照说明书进行操作，正常参考范围为7.5～20.1 μg/L。

1.5 质量控制 所使用仪器每年进行一次计量检测，均须合格。所使用试剂均有注册证。Hcy及叶酸测定参加了国家卫健委临床检验中心室间质评。测定样品时均做室内质控，在控时才可检测。

2 结果

2.1 MTHFRC677T位点TT基因型Hcy与叶酸浓度 见表1。MTHFRC677T位点TT基因型者，叶酸浓度降低，Hcy浓度升高，叶酸与Hcy浓度两组比较，差异均具有统计学意义(P=0.000)。

项 目观察组(n=110)对照组(n=118)t值P值Hcy(μmol/L)叶酸(μg/L)25.9±2.94.9±2.610.5±1.815.5±1.99.8358.3560.0000.000

2.2 MTHFRC677T位点TT基因型不良妊娠结局者与正常人群的比较 在110例TT基因型观察组中，发生不良妊娠结局者21例，发生频率为19.1%，而对照组118例中，发生不良妊娠结局者只有5例，发生频率4.2%。两组数据经计数资料卡方检验，差异均有统计学意义(χ2=29.3，P=0.000)，两组差异具有统计学意义，MTHFRC677T位点TT基因型不良妊娠结局发生频率高于对照组。

2.3 Hcy与叶酸的相关性 见图1。对两组数据进行Pearson相关分析，结果显示Hcy与叶酸呈显著负相关，相关系数r=-0.859，回归方程为：Y=-0.785X+0.913。以叶酸为Y轴，以Hcy为X轴，做散点图，进行相关性分析，两组数据差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 MTHFR基因分布频率及分布特点 乌鲁木齐地区育龄妇女MTHFRC677T位点TT基因型频率为24.5%(110/449)。与相关文献报道[4]的乌鲁木齐地区汉族女性MTHFR677T纯合突变基因型频率24.1%(52/216)相接近。高于惠州(10.9%，39/359)，柳州(9.2%，24/260)等[5，9]地区，差异有统计学意义(χ2=39.3，45.9，均P=0.000)；与银川(23.0%，102/443)，延安(26.7%，403/1 508)，镇江(21.8%，630/2 885)等[6-8]地区比较，差异无统计学意义(χ2=0.18，P=0.983；χ2=5.21，P=0.74；χ2=2.16，P=0.361)。

图1 Hcy与叶酸相关性散点图

3 讨论

3.1 MTHFRC677T基因多态性是第677位点突变，它是目前发现最常见的基因突变位点，该位点的变化是碱基胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置换，这种功能性的突变直接影响MTHFR酶的活性和耐热性。该位点突变有3种基因型：野生型CC，杂合突变型CT，纯合突变型TT。TT型的活性仅为CC型的30%，加热5 min后，CT型酶活性为56%，而TT型酶活性仅为22%， CC型作为对照组剩余酶活性为67%[1]。中国汉族人群C677T的突变频率为40%，MTHFRC677C等位基因频率分布呈现地理梯度，突变频率随着纬度的增加先增加再减少。TT型基因频率在南方地区为6.6%，中部地区为14.2%，北部地区为21.3%，最北部地区为15%。MTHFR位点的多态性可能会引发孕妇妊娠高血压，而且与不明原因反复自然流产也有关(TT型基因)，也增加胎儿心脏畸形的发生率，同时增加伴随先天性心脏病的先天愚型(也称唐氏综合征)患儿的出生率。也是引起流产或使胎儿生长受限等的原因。由于与孕妇疾病及出生缺陷的相关性，MTHFR位点已被列入计划生育常规体检项目，女性在怀孕期间最好进行“孕期叶酸需求”基因检测。

3.2 叶酸是合成核酸必不可少的元素之一，但是不能在人体内合成，因此必须从外界获取。叶酸代谢是一个复杂的生化过程。在叶酸代谢过程中，涉及到的一些酶具有多态性。由于个体遗传差异因素的存在，MTHFR基因发生突变者，就导致对叶酸的利用率降低，使孕妇补充等量叶酸后，但是体内的叶酸活性存在差异。研究表明，MTHFR基因多态性是叶酸代谢障碍发生的重要因素[10]。

3.3 Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个中间产物，损伤血管内皮细胞。血清Hcy水平亦是心脑血管疾病的独立危险因素。高同型半胱氨酸血症严重影响血管增殖和相应的修复功能，从而引发孕妇体内胎儿发生血管病变和凝血系统障碍等，故必须保持体内Hcy浓度处于平衡状态。叶酸代谢相关酶活性正常，才能维持体内Hcy水平。影响Hcy代谢的因素主要有环境和遗传两个方面。遗传因素方面，有文献报道，MTHFR基因的677位点突变后，血清中Hcy浓度会显著升高。在MTHFR患者中，带有TT基因型的患者血清中Hcy浓度明显高于CC基因型患者。孕妇检测MTHFR基因C677T位点基因型，并结合血清Hcy浓度测定，有助于预防出生缺陷的发生。