应用Time-lapse优选胚胎观察胚胎发育速度对单胚胎移植妊娠结局的影响

陈磊，季悦，王珊珊，姜伟华，王沛青

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心，南京 210008)

随着辅助生殖技术的飞速发展，多胎妊娠率也逐年增高，从而导致母婴并发症也越来越多[1-2]。单胚胎移植作为降低多胎妊娠的有效手段之一，得到人们越来越多的重视。相对于双胚胎移植而言，要保证较好的妊娠结局，单胚胎移植对移植胚胎的质量要求更高。目前移植胚胎的选择依据仍然主要是形态学观察指标，卵裂球数目能够有效的反映胚胎的发育速度，可以预测胚胎活力与妊娠结局。根据Istanbul共识，Day 2卵裂球数目为4细胞，Day 3卵裂球数目为8细胞的胚胎具有较高的着床能力[3]。同时Magli等[4]研究指出，Day 3的8细胞阶段的胚胎是理想的移植胚胎。然而，临床上有较多患者会获得发育较快的Day 3受精胚胎(>8细胞)，这类胚胎移植的妊娠结局状况鲜有研究报道。

本研究将应用时差成像系统(Time-Lapse imaging，TLI)培养技术，基于卵裂模式与时间参数分层筛选模型优选胚胎进行移植，回顾性分析了胚胎发育速度单因素对单胎妊娠结局的影响，探讨具有较快卵裂率的胚胎的发育潜力和应用前景。

资料与方法

一、研究对象

对2014年4月至2017年5月在南京鼓楼医院生殖中心行常规体外受精(IVF)单分裂胚移植的患者资料进行回顾性分析。患者纳入标准：(1)因盆腔输卵管因素行IVF助孕；(2)常规IVF周期；(3)获卵数为5～15枚；(4)月经第3日FSH<12 U/L；(5)女方年龄<40岁；(6)周期数<2个；(7)常规促排卵方案[5]。排除标准：(1)PGS/PGD周期；(2)供卵周期；(3)男性因素不育；(4)移植日内膜<8 mm。

根据第3天移植胚胎的卵裂球数目分为8～9细胞组(n=168)、10～11细胞组(n=36)、12～16细胞组(n=30)，且10～11细胞组、12～16细胞组中均无符合优质胚胎筛选条件的8～9细胞胚胎。

二、研究方法

1.TLI系统：本研究所采用的时差成像系统是Primo Vision TLI(Vitrolife，瑞典)[6]，它是将培养箱与胚胎倒置显微镜相结合，通过数据线将胚胎发育过程中所采集到的图片传输到培养箱外的显示器上，拍照频率为5 min/次，能够有效地监测胚胎发育的整个过程。此培养系统有自己专用的集合培养皿(WOW)，WOW是一种9孔培养皿，每个孔都有自己独立的数字编号，便于胚胎学家区分。

2.配子的采集与胚胎培养：采用常规促排卵方案，B超监测卵泡生长，待主导卵泡直径达到18～20 mm后注射HCG(珠海丽珠制药)，36 h后行阴道B超引导下卵泡穿刺取卵术。获卵3 h后，采用短时受精法，将采集到的人卵母细胞与精子按1∶10 000的比例混合加入IVF(Vitrolife，瑞典)微滴中，共同孵育5 h后机械剥除颗粒细胞，通过观察第二极体是否释放来判断受精情况，之后将受精卵转移至含有G1(Vitrolife，瑞典)培养液的WOW集合培养皿中，置于Primo Vision TLI系统培养观察到第3 d进行移植。

3.胚胎评估：根据Istanbul共识对分裂期胚胎质量进行评分。以授精时间为起点，通过时差成像系统记录胚胎发育过程中的卵裂模式与时间参数，采用本中心建立的胚胎筛选模型进行胚胎筛选[7]。移植胚胎筛选范围是：卵裂模式为正常、不均或非轴性卵裂，且时间参数符合s2<0.50 h (s2=t4-t3，即停留在3细胞阶段时间)、t5<48.93 h (5细胞分裂时间)。如该患者无符合上述筛选条件的胚胎，则不纳入本研究范围。

4.移植与妊娠结局判定：单胚胎移植周期中，在TLI系统中培养到第3天，优先移植符合筛选条件的8细胞胚胎，若无则选取符合筛选条件的卵裂速度较快的胚胎(≥9个细胞)移植后常规黄体支持，2周后检测血HCG 当血HCG>5 U/L，4～6周B超检查见孕囊及胎心为临床妊娠。

三、统计学分析

结果

一、根据移植胚胎发育速度分组的患者一般临床资料与结局

8～9细胞组、10～11细胞组和12～16细胞组3组患者的年龄、体重指数(BMI)、获卵数、基础FSH、基础LH、内膜厚度等均无显著差异(P>0.05)；3组间种植率、流产率、活产率亦无显著差异(P>0.05)(表1)。

二、根据移植胚胎的卵裂球数目奇偶数分组的患者一般临床资料与结局

奇数组和偶数组两组患者的年龄、BMI、获卵数、基础FSH、基础LH、内膜厚度等均无显著差异(P>0.05)。两组临床结局比较，偶数组的种植率、活产率均显著高于奇数组 (P<0.05)。偶数组的流产率低于奇数组，但差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表1 不同胚胎发育速度患者基本信息与临床结局[(-±s)，%]

表2 卵裂球奇偶数患者基本信息与临床结局[(-±s)，%]

注：与偶数组比较，*P<0.05

三、根据偶数卵裂球胚胎发育速度分组的患者一般临床资料与结局

将卵裂球数目为偶数的胚胎按照胚胎发育速度分为8细胞组、10细胞组和12～16细胞组进行分析，3组患者的年龄、BMI、获卵数、FSH、LH、内膜厚度等均无显著差异(P>0.05)，3组间种植率、流产率、活产率亦无显著差异(P>0.05)(表3)。

表3 不同发育速度的偶数卵裂球胚胎患者基本信息与临床结局[(-±s)，%]

讨论

单胚胎移植技术中胚胎选择是关键，静态学评估是目前大多数生殖中心常用的评价胚胎移植前活力的方式[8]。根据ESHERE发布的2011版Istanbul共识，在受精后(68±1)h观察胚胎，综合比较其卵裂球大小、数目、胞质碎片、空泡等静态学参数，从而挑选出最优质胚胎进行移植。但形态学指标并不能准确地反映出胚胎发育的实际情况，其卵裂方式是否异常，卵裂是否同步均无法体现。近年来兴起的时差成像技术通过连续摄像能够有效克服这些弊端，Pribenszky等[9]研究证明，与普通培养箱经静态形态学参数评估相比，通过Time-lapse培养，运用形态动力学参数挑选胚胎可显著提高妊娠率及活产率。本中心前期研究证明，相对于传统的静态形态学评估，TLI挑选优质胚胎行Day 3单胚胎移植的临床妊娠率可提高27%[10]。本研究所基于的时间参数是s2<0.5 h和发育至5细胞时间(t5)<48.93 h，有相关研究报道，在此时间参数范围内挑选的胚胎能够有效提高患者的怀孕几率，并减少多胎妊娠的发生[7]。

由于患者卵子与精子自身的原因，以及培养环境和操作损伤等影响，绝大部分受精卵并不能发育成优质的8细胞胚胎。较多胚胎发育速度较快，移植当日已经达到10细胞，有些甚至达到14细胞。在传统的静态形态学观察下，在有形态较好的8细胞胚胎的情况下，10细胞及以上的胚胎一般不用于移植，将会继续培养观察。通过TLI，我们发现有许多胚胎于Day 3发育成8细胞，并且形态比较完美，但是卵裂过程可能存在许多异常事件,例如异常卵裂、卵裂球多核等[11]。Wong等[12]研究表明，两个形态相同的胚胎可能会经历完全不同的发育过程。本研究通过TLI系统对胚胎发育进行动态观察，探究患者在无符合时间参数且卵裂球数目为8的优质可移植胚胎的情况下，挑选满足时间参数且卵裂球数目大于8的胚胎移植，其临床结果是否存在差异。结果显示，在种植率方面，8～9细胞为61.90%，10～11细胞为53.80%，12～16细胞为53.33%，并不存在统计学差异(P>0.05)。而洪焱等[13]研究发现，大于8细胞的单胚胎着床率要低于8细胞胚胎，但其样本量较少，可能是导致本研究结果与其不一致的原因。Chimote等[14]研究认为，在发育速度较快的胚胎中约有70%左右的染色体异常者在囊胚形成过程中被淘汰，从而导致了囊胚的质量相对提高，有着更好的发育潜能，这一现象在一定程度上解释了本研究中移植卵裂球数目较多的胚胎，患者的流产率并没有明显提高，而Alikani等[15]通过对受精后第3天不同发育速度胚胎的囊胚形成比较发现，细胞数为7～9的胚胎其囊胚形成率明显高于细胞数>10的胚胎。

以往的研究早已证实，胚胎的卵裂球发育速度与染色体状况有关[16]。在静态学评分系统下，受精后Day 3，卵裂球数目大于10的胚胎经常存在由于卵裂球排列紧密导致将碎片等胞质结构误认为卵裂球的现象。在细胞数较多的情况下，卵裂球和碎片的区别很难用肉眼去区分，尤其是在含有大碎片以及一些卵裂球严重不均的胚胎中更是如此[17]。静态评分为10细胞乃至12细胞，很可能包含了 1至2个大碎片，这些细胞质碎片是从受精胚胎或早期胚胎排出的膜包裹的细胞质结构，含DNA的可能性非常低。同时Alikani等[15]发现含有大碎片的胚胎与含有较小、分散碎片的胚胎相比，其种植率明显降低。胚胎的发育是一个动态过程，人为选择胚胎观察的特定时间点，根据形态参数和当前的发育状况选择胚胎，本身就存在一定的局限性，在发育过程常发生的非二倍性卵裂方式，会导致在静态学观察下细胞发育过快。这都有可能是部分研究显示大于10细胞的胚胎发育潜能低于7～9细胞的原因，而TLI技术通过实时监测系统可以有效避免这一问题。

本研究结果显示，卵裂球数目为奇数的胚胎其种植率与活产率要显著低于卵裂球数目为偶数的胚胎。这可能是由于卵裂球数目为偶数的胚胎染色体正常比例要高于奇数胚胎，与刘见桥等[18]研究结果相符。为避免卵裂球奇偶数对卵裂速度分组的影响，本研究将三组中卵裂球为奇数的胚胎去除后，分别对8细胞组，10细胞组，12～16细胞组进行分析，结果显示，三组种植率、流产率、活产率均无显著差异(P>0.05)，与不分卵裂球奇偶数的结果一致，表明本研究分组的结果不受卵裂球奇偶数的影响。

综上所述，TLI技术是一种新兴的胚胎监测手段，能够更加有效的帮助胚胎学家选择优质胚胎进行移植。在本项研究中我们发现在同样符合时间参数与卵裂模式的条件下，相对于8细胞而言，移植10细胞及以上的胚胎其种植率、流产率、活产率等方面并没有显著差异。在临床助孕治疗过程中，对于未获得发育速度正常且符合时间参数的胚胎的患者而言，移植符合时间参数但是发育相对较快的胚胎仍然可以获得较好的临床结局。此研究不足之处在于移植10细胞以上和卵裂球数为奇数的胚胎样本量相对较少，在今后的研究中，我们将不断扩大样本量予以考证。