酪蛋白磷酸钙复合体对乳牙脱矿釉质再矿化作用的体外实验研究

赵岩 高平

龋病是常见儿童口腔疾病之一。乳牙龋病不仅影响患儿的咀嚼功能和面部美观，更重要的是影响牙弓和颌骨的发育。在龋病的防治中，早期未形成龋洞时可以采用再矿化疗法进行治疗，使脱矿釉质再矿化，阻止龋病进一步恶化，从而恢复牙体形态。因此，对乳牙早期龋病的控制显得十分重要。

针对釉质脱矿通常可采用再矿化治疗，最为典型的防龋制剂是氟化物，包括氟化物溶液、含氟牙膏、含氟涂料等［1］。但氟制剂存在潜在的毒副作用和诱使耐氟菌株的产生等弊端［2］，这些都限制了氟化物防龋的临床应用。因此，寻找新的安全有效的生物防龋制剂势在必行。以酪蛋白磷酸钙复合体（CPP-ACP）为主要成分的再矿化制剂，具有致敏性小、无细胞毒性、食用安全的优点。动物及人原位龋病模型研究和体外实验均已证实CPP-ACP有抗龋性［3］。为此，本研究选择CPP-ACP进行实验，用Micro-CT扫描和三维重建软件检测标本，通过对乳牙牙齿脱矿区域体积进行量化分析及长期观察，初步探讨CPP-ACP对乳牙牙齿釉质的再矿化能力，为乳牙早期釉质龋病的再矿化治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本

选择不同个体的乳牙20颗，肉眼观察牙体表面光滑、平整、且无裂纹、无着色及无缺损。将实验牙用抛光轮在流水下对唇面釉质依次抛光，在离体牙标本颊面留出约2 mm×2 mm开窗区，开窗区四角各钻直径0.3 mm圆形凹陷用于定位，其余牙体部分用抗酸性指甲油封闭。标本用350 ml/L的乙醇浸泡24 h，清水冲洗后放在0.9%生理盐水中4℃冰箱保存，每日更换生理盐水，保存期不超过30 d。

1.2 材料与仪器

1.2.1 材料 CPP-ACP（GC，日本），NaF（3M，美国），人工致龋液［4］：硝酸钙2.2 mmol/L，磷酸二氢钾2.2 mmol/L，醋酸50 mmol/L，氟化钠0.1 mmol/L，用5 mol/L KOH调至pH为4.5。人工唾液：NaCl 0.4 g，KCl 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.795 g，NaH2PO4·2H2O 0.78 g，Na2S·2H2O 0.005 g，脲素1.0 g，蒸馏水稀释至1 000 ml，使其pH值为6.8。

1.2.2 实验仪器 Micro-CT（SkyScan 1174型，Bruker公司，比利时），电子恒温水浴箱（上海医疗器械厂）。

1.3 方法

将试件完全浸泡于5 ml人工致龋液中，放入37℃恒温水浴箱中96 h，每12 h更换1次人工致龋液。样本釉质脱矿区制备完成后，随机分为4组，每组均为5个样本，即A组：去离子水，B组：0.2%氟化钠，C组：10%CPP-ACP，D 组：0.2%氟化钠 +10%CPPACP。

各组样本分别用去离子水、NaF、CPP-ACP、NaF+CPP-ACP涂布牙面5 min，自然晾干，每天的9：00和18：00各1次。间隔期浸泡于人工唾液中，每24 h更换1次人工唾液。实验持续28 d，在乳牙脱矿前和再矿化第0天，第14天和第28天进行Micro-CT扫描。

采用Micro-CT扫描标本，样本放在转台上，X射线束垂直于牙齿的颊面，扫描条件：电压100 kV，电流100μA，像素分辨率0.03 mm，整合时间1 200 ms，共获得276张断层影像，扫描时间为55～60 min。利用CTan分析软件读取TIFF格式数据，首先选用局部阈值法，根据正常牙体组织和釉质脱矿区的灰度值的差异，得到釉质脱矿区的二值化图像（图1），然后选择体积（mm3）参数，测量乳牙釉质脱矿区的体积变化。

图1 Micro-CT断层图像Fig 1 Micro-CT images of the tooth samples

1.4 统计学处理

使用SPSS 18.0统计软件对实验数据行单因素方差分析和LSD-t检验。所有数据均以±s表示，以P＜0.05为差异具有显著性。

2 结 果

各实验组不同矿化时间的脱矿区体积测量结果见表1。

表1 各实验组不同矿化时间的脱矿区体积变化（n=5，±s）Tab 1 The volume of the demineralization at different times（n=5，±s）

表1 各实验组不同矿化时间的脱矿区体积变化（n=5，±s）Tab 1 The volume of the demineralization at different times（n=5，±s）

注：①与A组比较，P＜0.05；②与B、C组比较，P＜0.05

组别 体积（mm3）再矿化后0 d 再矿化后2周 再矿化4周0.52±0.20 0.51±0.15 0.53±0.19 B组 0.55±0.18 0.56±0.20① 0.55±0.20①C组 0.57±0.15 0.54±0.11① 0.51±0.11①D组 0.58±0.19 0.53±0.12①②0.49±0.16 A组①②

采用单因素方差分析对4组数据进行总体分析，结果显示：同一时间4个实验组的脱矿区体积不相同，差异有统计学意义（P＜0.05）。

采用LSD-t检验进行组间两两比较。结果显示：A组与B、C、D组、B组与D组及C组与D组间脱矿区体积的差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

依据第3次全国口腔健康流行病学调查数据，5岁年龄组儿童乳牙龋病的患病率为66.0%，12岁年龄组儿童恒牙龋病的患病率为28.9%［5］。因此，预防龋病，降低龋病发病率，对提高人群的健康水平和生活质量都具有重要意义。有学者发现牙釉质表层的脱矿和再矿化是一个持续的过程。早期釉质龋损如及时采取再矿化措施则可阻止龋损的进展，避免龋洞形成。因此许多研究采用多种方法促进釉质表面的再矿化，从而使早期龋达到不同程度的控制，来阻止龋病的发生［6］。长期以来氟化物是釉质再矿化的主要制剂［7-8］，但由于地方区域性特点，应用氟化物防龋，使用的氟浓度差异很大，同时过量使用氟化物会导致氟中毒和氟牙症，还会诱使耐氟菌株的产生等，这些不足之处都限制了氟化物在乳牙早期釉质龋的临床应用。近年来学者们发现CPP-ACP抑制牙釉质脱矿并促进早期光滑面龋再矿化的作用。张晓洁等［9］用显微硬度计来评价CPP-ACP对牙釉质脱矿区的再矿化情况，结果显示实验组牙釉质显微硬度高于阴性对照组，证明CPP-ACP在体外实验中能促进牛釉质再矿化。

目前釉质矿和再矿化的检测方法的研究方法主要有：X射线显微照相术、显微硬度测定、共聚焦激光扫描显微镜检测法、原子光谱测定法等［10］。以上研究方法均需破坏样本，这就容易丢失牙体组织信息，而且无法对同一样本进行连续观察，造成测量结果误差较大。随着医学影像技术及计算机图像处理技术的进步，Micro-CT和三维重建技术在骨科学、口腔科学、骨替代材料等领域的应用日趋广泛。它具有定位准确、无创伤、无间隔、可重复、分辨率高，较高的可靠性等优点。Micro-CT拥有极强的图像分辨率和强大的图像处理软件，在不破坏标本的前提下可以连续观察和定量计算样本内部感兴趣区的体积、面积、孔隙率等指标。Hamba等［11］应用Micro-CT和横断显微照相技术（TMR）测量牙釉质的脱矿深度和矿物质密度，结果发现两者之间具有相关性，表明Micro-CT可以替代横断显微照相技术进行釉质脱矿的研究。其它研究结果说明Micro-CT是评价釉质矿化程度的有效方法［12-13］。为此，本研究通过Micro-CT扫描和三维重建软件检测标本，测量乳牙釉质脱矿区体积的变化情况，来评价CPP-ACP再矿化效能。

本实验应用Micro-CT扫描和三维重建软件，定量研究乳牙釉质脱矿区的体积，用体积参数评价CPPACP再矿化效能，排除了人为因素的干扰，减少了主观的偏倚。本研究发现，再矿化2周及4周时，10%CPP-ACP组和0.2%氟化钠组的脱矿区体积显著低于于去离子水对照组。此结果表明，CPP-ACP有促进脱矿釉质再矿化的能力，其作用与0.2% NaF组相似。这与龙宝军等［14］学者的实验结论相一致。其作用机制可能是：CPP-ACP可提高牙表面的钙磷质量浓度，减缓游离钙的扩散，在牙表面形成一个钙离子库，阻止不溶性磷酸钙的形成，从而减少釉质的脱矿并为再矿化提供钙源。本实验显示，再矿化2周及4周时，0.2%氟化钠+10%CPP-ACP组的脱矿区体积显著低于10%CPP-ACP组和0.2%氟化钠组。其结果说明：NaF和CPP-ACP联合后的再矿化能力显著高于其他组。NaF与CPP-ACP联合使用可以促进恒牙再矿化已得到许多研究的证实［15-16］。其作用机制可能是氟离子存在于CPP-ACP溶液中时，氟离子被吸附进入了CPP结合的ACP相，形成了一种新型的非结晶型磷酸氟钙相（ACFP）。ACFP溶液中的氟离子活性增强，更具有渗透力，能够进入龋损深层，促进再矿化时晶体的生长。

总之，本实验研究表明NaF和CPP-ACP均能促进脱矿乳牙牙釉质再矿化，两者联合使用则效果更佳。此外采用Micro-CT测定脱矿区体积来评价乳牙矿化和再矿化的效果，为研究提供了一个有价值的方法。当然本实验无法完全模拟临床情况，接下来的实验中会进一步深入研究。