白芷中香豆素类成分渗漉提取工艺的优化

黄家佳， 龙晓燕， 王 瑞， 李光英

（西南科技大学，四川 绵阳621000）

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.或 杭 白 芷 Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss）Shan et Yuan 的干燥根，主要用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带异常、疮疡肿痛［1］，其主要成分为香豆素、挥发油，其中有效镇痛物质是前者，并且有一些具有抗氧化、抗增殖活性［2-3］，如欧前胡素、异欧前胡素等。本实验建立HPLC 法测定欧前胡素含有量［4］，并在单因素试验基础上通过正交试验优化白芷中香豆素类成分渗漉提取工艺［5-6］，以期为相关研究提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 EC2000 高效液相色谱仪（配置UV230＋紫外-可见检测器、手动进样器，大连依利特分析仪器有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DLSB-5120 低温冷却液循环泵（上海贤德实验仪器有限公司）；KQ-300TDE 高频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HX-200 高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；AR124CN 电子天平［奥豪斯仪器（上海） 有限公司］。

1.2 试药 白芷（批号G07816F01） 购自四川中庸药业有限公司，经专家鉴定为正品。 欧前胡素对照品 （批号T9MZ-FFSK，上海源叶生物科技有限公司）。甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 粉碎度考察 取药材适量，粉碎，称取粉碎度10、20、30、40 目的各20 g，40 mL 80%乙醇湿润浸泡，装筒，加入8 倍量80%乙醇，渗漉速度3 mL／ （min·kg），浸泡时间12 h，渗漉液置于50 ℃水浴中浓缩定容至50 mL 量瓶中，再吸取2.0 mL 定容至10 mL 量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤。结果发现，粉碎度20 目时欧前胡素含有量最高，故选择其进行后续实验。

2.2 对照品溶液制备 精密称取欧前胡素对照品10.00 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，精密吸取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得（每1 mL 分别含0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg 欧前胡素）。

2.3 供试品溶液制备 将药材粉碎成粗粉，过20 目筛，称取20 g，40 mL 乙醇湿润浸泡，装筒，续加乙醇，静置，渗漉，渗漉液置于50 ℃水浴中，浓缩定容至50 mL 量瓶中，再吸取2.0 mL 定容至10 mL 量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇∶水（65 ∶35）；检测波长300 nm；柱温室温；体积流量1.0 mL／min；进样量20 μL。色谱图见图1，理论塔板数不低于3 000。

2.5 线性关系考察 吸取“2.2” 项下对照品溶液，以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y ＝21 596.95X ＋438.653（R2＝0.999 67），在0.06～0.14 mg／mL 范围内线性关系良好。

图1 欧前胡素HPLC 色谱图

2.7 单因素试验［7］

2.7.1 乙醇体积分数 固定料液比1 ∶8，浸泡时间12 h，渗漉速度4 mL／ （min·kg），乙醇用量40 mL，考察50%、60%、70%、80%、90%乙醇对提取效果的影响，结果见图2。由图可知，60%乙醇提取时欧前胡素含有量明显高于50%乙醇，故选择50%、60%、70%这3 个水平进行考察。

图2 乙醇体积分数对欧前胡素含有量的影响

2.7.2 料液比 固定乙醇体积分数70%， 渗漉速度4 mL／（min·kg），乙醇用量40 mL，浸泡时间12 h，考察料液比1 ∶6、1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10 对提取效果的影响，结果见图3。由图可知，料液比1 ∶9 时欧前胡素含有量明显高于1 ∶8，故选择1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10 这3 个水平进行考察。

图3 料液比对欧前胡素含有量的影响

2.7.3 渗漉速度 固定乙醇体积分数70%，料液比1 ∶9，乙醇用量40 mL，浸泡时间12 h，考察渗漉速度3、4、5、6、7 mL／（min·kg）对提取效果的影响，结果见图4。由图可知，渗漉速度在5 mL／（min·kg）时欧前胡素含有量明显高于4 mL／（min·kg），故选择3、4、5 mL／（min·kg）这3个水平进行考察。

图4 渗漉速度对欧前胡素含有量的影响

2.7.4 浸泡时间 固定乙醇体积分数70%，料液比1 ∶9，乙醇用量40 mL，渗漉速度5 mL／（min·kg），考察浸泡时间6、12、18、24、30 h 对提取效果的影响。结果见图5。由图可知，浸泡时间18 h 时欧前胡素含有量明显高于12 h时，故选择12、18、24 h 这3 个水平进行考察。

图5 浸泡时间对欧前胡素含有量的影响

2.8 正交试验 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、渗漉速度（C）、浸泡时间（D） 为影响因素，进行4 因素3 水平L9（34） 正交试验［8］。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平

表2 试验设计及结果

表3 方差分析

由表1 可知，各因素影响程度依次为B＞D＞A＞C；由表2 可知，因素B、D 有显著性影响（P＜0.05），以前者更明显。综合考虑，最优工艺为A2B1C2D1，即8 倍量60%乙醇浸泡12 h，渗漉速度4 mL／（min·kg），欧前胡素含有量为1.489 5 mg／g。

2.9 验证试验 按“2.7” 项下优化工艺进行3 批验证试验，测得欧前胡素平均转移率为95.12%，RSD 为1.34%，表明工艺稳定可行。

3 讨论

白芷中香豆素类成分欧前胡素和异欧前胡素受热不稳定，前者易发生Claisen 烯丙基重排，生成别欧前胡素，即使在真空中加热也会如此［9］。前期曾采用水蒸气蒸馏法提取白芷，但得率低，耗时长，浪费能源，同时易破坏其他有效成分［10］，故本实验采用乙醇渗漉法提取，能较好地保留有效成分。

由于粉碎度过细时，提取率反而会下降［11］，故白芷在提取过程中不宜粉碎过细，避免提取过程中发生堵塞渗漉筒现象，影响提取效果。同时，采用粗粉进行提取，即方便操作，也符合渗漉法提取特点和要求。

在含有量测定时，曾采用精密量取提取液，低温蒸干后甲醇溶解残渣的方法来制备供试品溶液，但在甲醇溶解、转移过程中会造成有效成分的损失。因此，采用提取液稀释后进行测定，该方法操作简便，结果可靠。