肉桂醛对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠模型骨密度和骨量的保护作用

杜秀藩 黄弘轩 熊小龙 曾维鹏 黄晖 王广积 沈宁江 林坚平

1.海南省人民医院关节外科，海南 海口 570311 2.广州医科大学附属第一医院骨科，广东 广州 510230

骨质疏松症是一种常见的慢性骨疾病，其特征在于骨微结构的恶化和骨量的减少。它影响两性，但是在女性中与男性相比更常见[1-3]。在绝经后期骨质流失更快。骨质疏松症最重要的后果是发生在椎体、髋部和前臂的骨折。特别是髋部骨折是死亡率和发病率的重要原因。随着预期寿命的增加，这种并发症的发生会更为频繁[4]。骨质疏松症隐袭发展，其临床症状可能不会出现，直到骨折发生。在后期，临床上表现为突发性骨折。因此，通过早期诊断和正确治疗可以预防骨质疏松症，这一点非常重要。目前常用于绝经后骨质疏松症的药物是双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、降钙素、雌激素、重组人甲状旁腺激素片段等；较高的不良反应如非典型股骨骨折、双膦酸盐相关的颌骨坏死、高钙血症、血栓栓塞、阴道出血甚至乳腺癌和子宫内膜癌严重限制这些药物的广泛使用，因此，疗效满意且不良反应小的药物值得深入研究。大多数植物来源的中药可能是一种具有广阔应用前景的药物。肉桂醛是一种从肉桂皮中提取的醛类成分，已知可用于抑制炎性细胞因子的产生，从而提供抗菌活性。最近，有学者发现用肉桂可抑制核因子-κB配体诱导活化T细胞核因子和激活c-fos表达，并且肉桂醛可以有效抑制破骨细胞样细胞形成[5]，这些结果可以得到一个假设，肉桂醛(RGQ)具有治疗骨质疏松的潜力。本研究的目的是研究肉桂醛对大鼠去卵巢手术诱导的骨质疏松模型中BMD和微结构的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

在该研究中，使用24只健康的成熟雌性Sprague-Dawley大鼠，每只体重220～250 g。动物随意喂养，并与温度控制环境22±2 ℃和12 h光照/黑暗周期成对饲养在钢笼中。实验程序由我院动物研究委员会批准。所有的动物研究都严格按照人类关怀委员会的动物实验指南进行。

1.2 实验设计

24只大鼠进行双侧背侧卵巢切除术(OVX)，8只大鼠未进行卵巢切除术。对于外科手术，通过腹膜内注射剂量为80和7 mg/kg甲苯噻嗪盐酸盐(Alfazyne; Alfasan International BV，Woerden，Holland)和盐酸氯胺酮的组合麻醉大鼠。所有大鼠在去卵巢手术8周后。将他们分成3组。CON组(n=8)是对照组和未治疗。OVX组(n=8)是OVX大鼠和未治疗；RGQ组(n=8) OVX大鼠给予肉桂醛75 mg/(kg·d)治疗，根据之前的实验研究选择肉桂醛的剂量[6]。治疗12周后，通过Hologic QDR-4 500 A和“小动物”程序测量全身麻醉下左股骨近端和腰椎两个区域的大鼠BMD。然后将动物安乐死，采集血样、取出股骨进行组织病理学检查。

1.3 骨组织病理学检查

对于组织学和免疫组织化学研究，所有动物通过腹膜内麻醉。使用氯胺酮(80 mg/kg，Ege Vet，Alfasan International BV，Holland)/甲苯噻嗪(7 mg/kg，Ege Vet，Alfasan International BV，荷兰)进行过量麻醉处死大鼠。解剖动物的左股骨并在室温10%甲醛固定剂中保存24 h用于组织形态计量学分析。将标本放入10%甲酸中。脱钙28 d，然后用光学显微镜进行常规检查。用Leica MR 2145切片机将脱钙固定的左股骨横切成厚3 μm切片，用苏木精-伊红染色后进行形态测定分析。

1.4 骨小梁形态测量分析

对于每只动物，从石蜡块的左后肢股骨近端干骺端连续获得5张横切片，用于形态测定分析。切片用苏木精-伊红染色，并用奥林巴斯显微镜拍摄20倍变焦数码照片。使用半自动数字系统UTHSCSA Image Tools for Windows Version 1.28测量了小梁计数、小梁厚度、小梁面积和小梁分离度。小梁测量在骺板附近0.46 mm处并且于股骨皮层两侧等距离处进行。使用该程序将长度计算为像素(1像素=128×10-8mm)。所有测量均按照Parfit等[7]的文章进行。

1.5 形态测量

对于小梁厚度(μm)和小梁分离度，需对每个小梁至少50个不同点处进行测量，直到平均值变得恒定。通过计数所有骨小梁和每个小梁彼此平行，距离皮层两侧等距离的骨骺板0.46 mm处，获得小梁计数。小梁面积(mm2)通过确定小梁的边界在该区域测量小梁的数量来计算。

1.6 血清细胞因子水平的测量

将血液在室温下以3 000 r/min离心10 min并储存于-20 ℃备测。使用针对IL-6和TNF-α的市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(eBiosciences，Inc，San Diego，CA)测量细胞因子水平。根据制造商提供的指南严格进行操作。

1.7 统计学处理

使用非参数(Mann-WhitneyU)检验分析所有定量数据。Student的t检验被用来评估组间的差异。通过Kruskal-Wallis方差分析评估组间和组内的血清TNF-α和IL-6水平。数据以平均值±标准差表示。P<0.05被认为是差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度检测

各组之间的平均BMD值和组织形态学结果如表1所示。OVX组与CON组比较，股骨和腰椎BMD值显着降低(P<0.05)。在左侧股骨近端和腰椎BMD值方面，RGQ组和OVX组之间差异均有统计学意义 (P<0.05)。

表1 各组平均BMD值 (g/cm2)Table 1 Mean BMD values among the groups (g/cm2)

注：和CON组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

2.2 组织形态测量结果

OVX组的小梁数量、小梁厚度和小梁面积均显着低于对照组(P<0.05)。另外，OVX组小梁分离度显著高于对照组(P<0.05) (表2)。与OVX组相比，RGQ治疗显著增加小梁数量，小梁厚度和小梁面积并减少小梁分离度；差异均有统计学意义(P<0.05)。图1显示了各组大鼠股骨骨小梁的组织学切片。

表2 各组之间的组织形态测量结果Table 2 Histomorphometric results among the groups

注：和CON组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

图1 大鼠股骨骨小梁H&E染色注：A CON组；B OVX组；C RGQ组 (×20)。Fig.1 HE staining of the trabecular of the rat femurs

2.3 血清细胞因子水平

各组的血清细胞因子水平示于表3中。OVX组中的TNF-α和IL-6水平显着高于对照组(P<0.05)。与OVX组相比，RGQ治疗显着降低TNF-α和IL-6水平(P<0.05)。

表3 各组之间的平均血浆细胞因子水平Table 3 Mean plasma cytokine levels among the groups

注：和CON组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

3 讨论

骨质疏松症是绝经后妇女中常见的代谢性骨病。由于随着年龄的增长出现卵巢老化，雌激素合成的减少，表现为骨骼系统中的BMD减少和骨骼中的微结构恶化。绝经后骨质疏松症是最常见的骨质疏松症类型。在我们的研究中，RGQ治疗对大鼠手术诱导的绝经后骨质疏松症模型中的小梁骨微构造显示出相当大的保护作用。同时，股骨和腰椎骨密度均观察到这种效应。另外，RGQ的抗炎特性可以归因于保护作用。Bagi等[8]通过骨密度和组织形态计量学分析研究了卵巢切除术对大鼠骨量和骨强度的影响。他们观察到卵巢切除术可增加骨吸收，从而导致小梁数量、小梁厚度和骨强度的显著下降。Siu等[9]还在哺乳动物卵巢切除术之前和之后6个月使用高分辨率计算机断层扫描(CT)以及使用定量CT的BMD研究了骨微结构。在那项研究中，他们确定卵巢切除导致BMD减少以及所有微观结构参数的变化。至于骨的脆性，研究骨微结构与骨质疏松性骨折之间关系的观察性研究揭示了骨密度变化对骨结构的决定性作用，独立于BMD，同时研究指出，骨微结构是骨质量的重要组成部分，并为骨完整性提供重要贡献[10]。在我们的研究中，与对照组相比，除了卵巢切除术组的骨小梁微结构变化之外， BMD也有显著减少。

肉桂醛，肉桂树皮提取物，已知具有抗炎和抗癌的作用[11]。然而，肉桂醛的抗骨质疏松作用尚未在体内广泛地研究。本研究观察肉桂醛对去卵巢大鼠骨量和骨强度的影响。从结果来看，肉桂醛治疗的效果明显，肉桂醛能显著促进骨小梁的形成。此外，定量结果更好显示骨小梁检测的参数。随着肉桂醛的使用，骨密度(BMD)显著增高，骨强度明显增加。在细胞水平上，有学者使用来自肉桂皮的乙醇提取物显著诱导MCF-7细胞的生长，这是一种ER阳性的人乳腺癌细胞系，验证了肉桂乙醇提取物中植物雌激素的功能。并且他们还发现该提取物增加成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性，胶原合成和骨钙素分泌[12]。此外，肉桂醛具有抑制破骨细胞功能的效果；有学者发现肉桂醛能抑制破骨细胞样细胞形成和骨再吸收活性，主要目标被认为是c-fos / NFATc1途径[5]。NF-κB是一种调节炎症和免疫基因表达的转录因子，在骨质疏松症进展中也起着至关重要的作用。抑制NF-κB是抑制破骨细胞形成和骨吸收活性的有效方法，有学者指出，肉桂醛对NF-κB转录活性具有抑制作用[13]。在本研究中，OVX后破骨细胞的数量明显增加，并且随着肉桂醛的处理，其数量逐渐减少，从而抑制骨吸收活性。随着成骨细胞和骨形成的增加，骨代谢趋于平衡，然后骨质疏松症得到改善。

一些研究表明炎症可能导致骨质疏松症。有研究[14]表明在接受卵巢切除术的健康大鼠中IL-1和TNF-α增加，在卵巢切除术后8周达到最高水平，他们发现这些细胞因子水平的变化与骨吸收指数相关；此外在雌激素缺乏期间细胞因子如IL-6，IL-1，TNF-α和IL-8的产生增加诱导骨吸收；肝匀浆中测得的TNF-α，IL-1和IL-6显著增加，在去大鼠卵巢后血清IL-6和TNF-α水平显著升高。RGQ显示有效的抗炎作用，在细胞和分子水平发挥快速抗炎作用。在本研究中，我们发现与未治疗组相比，RGQ治疗的去卵巢大鼠血浆IL-6和TNF-α水平显著降低。为了预防继发于更年期的骨质疏松症，已经将多种药物用于治疗，并且新药的研究仍在进行中。

研究结果显示，我们不仅检测到RGQ对BMD的积极的影响，同时也发现它对骨微结构具有显著的保护作用。另外，RGQ治疗的血清IL-6和TNF-α水平显著下降。总之，RGQ可能是用于治疗绝经后骨质疏松症的候选药物。但是，需要进行进一步的临床试验。