高分子微针导入联合卡泊三醇软膏治疗小鼠银屑病的实验研究

梁 玲 ，陈博智 ，沈长兵 ，崔 勇 ⋆，郭新东 ⋆

（1.北京化工大学 材料科学与工程学院，北京 100029；2.中日友好医院 皮肤病与性病科，北京 100029；3.中国医学科学院北京协和医院 研究生院，北京 100730）

银屑病是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病。咪喹莫特是一种小分子免疫调节剂，可以诱导诱导用药部位产生炎症因子，出现类似银屑病的症状[1]。高分子微针预处理皮肤，可以形成微孔道，增加了药物的经皮渗透率，对银屑病的治疗起到很好地促进作用。但是缺少实验依据，无临床上的应用。本实验小鼠造模成功后用高分子微针处理，观察联合卡泊三醇对银屑病的治疗效果，为高分子微针导入药物治疗皮肤病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物为4～6周雌性Balb/c小鼠30只，体重16g左右，由维通利华提供，合格证号为京ICP备15004894号-1。在SPF级动物房内用标准饲料和小鼠专用水饲养，摄食饮水自由。

实验药品：5%咪喹莫特乳膏（3g：0.15g，四川明欣药业有限公司产，批号18060340），卡泊三醇软膏（15g：0.75mg，爱尔兰利奥制药有限公司产，批号 A70529），聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184，美国道康宁公司，批号 H04714G076），聚乳酸（PLA，Lakeshore生物材料有限公司）。

仪器：超声波清洗器（北京博翔兴旺科技有限公司，型号：BXXW-30AL）、激光刻蚀机（美国U-niversal，型号：VLS 3.5，50W）、小动物专用吸入麻醉机（美国Matrx集团，型号：VMR），数字波片仪（德国莱卡，型号：DM6 B）。

1.2 方法

1.2.1 高分子微针的制备

首先，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）板。将PDMS的预聚物和固化剂按质量比10：1混合，充分搅拌。在真空干燥箱内放置去除其中的气泡。将未固化PDMS倒入夹板中，在恒温恒湿箱60℃固化5h，得到PDMS板。然后，在PDMS板上平铺厚度为0.3mm的硅胶板，通过控制激光雕刻机激光的能量和速度打出所需高度的PMDS模板[2，3]。此实验中高分子微针规格为高度300μm，间距1000μm，底部直径 150μm（图1）。

1.2.2 动物分组

图1 高分子微针的光学显微图

将Balb/c小鼠适应性饲养2周，在30只小鼠内任取10只，作为组1（空白对照组），剩下的20只随机分为4组，分别为组2（造模组）5只、组3（咪喹莫特组）5只、组4（卡泊三醇治疗组）5只及组5（高分子微针处理组）5只。

1.2.3 造模方法

5%浓度的咪喹莫特乳膏均匀涂抹于小鼠两耳内外侧，给药量为 20mg/cm2，1次/d，连续涂抹6d，建立银屑病模型。

1.2.4 给药及处理方法

空白对照组不给予任何处理，其余组造模。造模d7，空白对照组随机处死5只，造模组全部处死，取耳部用组织固定液固定，做组织病理学研究。造模成功后，咪喹莫特组不做任何处理；卡泊三醇治疗组在两耳内外侧均匀涂抹卡泊三醇软膏，1次/d，每次30mg/cm2；高分子微针处理组先用高分子微针预处理，打开一条微孔道，再用卡泊三醇软膏治疗，治疗方法同卡泊三醇治疗组。治疗5d后，空白对照组剩余的5只小鼠与咪喹莫特组、卡泊三醇治疗组、高分子微针处理组小鼠一起处死，取耳部做组织病理学研究。

1.3 观察指标

肉眼观察小鼠耳部鳞屑、红斑、浸润、皮损情况，以评价造模效果及治疗疗效。光镜下观察耳部皮损病理变化，利用软件对图像进行分析，参照Baker法进行组织学评分[4]，并对炎症细胞浸润计数[5]。

1.4 统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计学处理，所有数据用均值±标准差表示，采用t检验和单因素方差检验进行统计分析。

2 结果

2.1 肉眼观察耳部形态结果

咪喹莫特处理的d2，小鼠耳部由白色变成粉红色，d4出现细小的白色鳞屑，血管扩张明显，严重部位有红斑出现。d7，角质层增厚明显，出现大片鳞屑，血管扩张明显。停用咪喹莫特乳膏后，有明显的好转，且用高分子微针处理优于只用卡泊三醇治疗（图2见封二）。

图2 各组小鼠双耳的形态比较

图3 小鼠耳部皮肤病理改变（HE×100）

2.2 光镜下观察结果

空白对照组光镜下观察可见皮肤结构完整，表皮层未见角化过度及角化不全、棘层增厚、颗粒层变薄或消失的情况，角质层很薄，真皮层未见毛细血管扩张或水肿，只有稀疏散在的炎症细胞浸润。造模组表皮层广泛存在角化过度、颗粒层变薄、棘层明显增厚，其中多处可见Munro微囊肿，真皮层毛细血管扩张、充血、水肿，血管周围有轻到中度的炎症细胞浸润。

表1 Balb/c小鼠耳部银屑病组织学评分及炎症细胞浸润评分

表1示，空白对照组和造模组的组织学评分和炎症细胞浸润评分，均存在显著性差异（均P＜0.01），表明造模成功。停用咪喹莫特乳膏，组3、组4、组5小鼠耳部皮肤有所改善，皮肤结构完整，表皮层的角化过度程度减轻，颗粒层变薄程度减轻，棘层增厚程度减轻，真皮层毛细血管扩张程度减轻。组5减轻程度较组3、组4高，表明高分子微针预处理对银屑病的治疗有效（图3见封二）。组4（卡泊三醇治疗组）与组5（高分子微针治疗组）比较，组5皮损减轻程度显著大于组4（P＜0.01），表明高分子微针预处理能促进药物吸收利用，更好地改善银屑病症状。

3 讨论

银屑病是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，其主要特征是角化过度或角化不全，角质层内出现中性粒细胞构成的Munro微囊肿，颗粒层变薄或消失，棘层增厚，血管扭曲扩张，管壁轻度增厚，真皮上部轻到中度炎细胞浸润[6，7]。银屑病病因复杂，目前主要认为与环境、遗传、感染、内分泌、免疫等因素有关，是多基因遗传背景下T细胞异常的炎症性疾病[8]。造模7d时，可看到小鼠耳部有大量鳞屑出现，局部有红斑，毛细血管扩张，符合银屑病的相关症状。

银屑病几乎不在动物身上出现，所以很难找到理想的动物模型[9]。咪喹莫特是一个小分子的免疫调节剂，能诱导用药局部产生多种炎症因子，出现类似银屑病的症状。本实验中用咪喹莫特造模[1]，刺激小鼠耳部出现银屑病症状。研究结果显示，造模组组织学评分与炎症细胞浸润评分与空白对照组对比均明显升高（P＜0.01），表明小鼠银屑病模型造模成功。

20世纪90年代以来，随着微机电加工技术的发展及经皮给药系统的逐渐完善，一种新的给药途径——微针经皮给药的出现，使得传统注射针法和膏药治疗的缺陷被弥补[10]。目前，应用于皮肤表面预处理增强药物渗透率的微针根据材质不同分为硅微针、金属微针和高分子微针。Park等人[11]采用生物可降解的高分子通过基于模具的制造方法来制备高分子实心微针。与硅微针和金属微针相比，高分子微针具有很多优势。首先，由于高分子聚合物具有粘弹性的性质，改善了高分子实心微针耐剪切诱导断裂的机械优点。其次，高分子实心微针通常在可以重复使用的模具中制备，因此高分子实心微针具有造价低，易于批量化制备的优点。此外，高分子微针有很好的生物相容性和可降解性，对皮肤伤害极小。最重要的是，微针在进行给药时，通过刺穿皮肤的最外层即角质层为药物的递送打开了一条由角质层到表皮层或真皮浅层的微通道，使得药物活性分子到达表皮层或真皮浅层时，能够更好地被吸收，从而增加药物经皮渗透率。本研究通过卡泊三醇治疗组、高分子微针处理组与咪喹莫特组对比，其评分明显降低（P＜0.01），表明卡泊三醇对咪喹莫特诱导的银屑病有很好的治疗作用，能够抑制银屑病皮损的增生和分化。高分子微针处理组评分明显低于卡泊三醇治疗组（P＜0.01），说明微针的预处理能够打开一条微孔道，使药物更容易进入皮肤，增加了药物的吸收利用率，增加银屑病的治疗疗效。

本研究证实，咪喹莫特造模操作简单，组织病理学上符合银屑病病理特征，是研究银屑病的一种理想模型。高分子微针预处理，能很好地改善银屑病模型的病理变化，为微针的临床应用提供了依据，将来有望应用于临床，解决银屑病患者给药吸收率低、效果差的问题。