顺铂-聚己内酯微球的研制及其缓释性能测试

林爱珠，方 芳，吴宏霞，刘天惠，柯 方，林 媚

顺铂是一种强效抗癌药物，是治疗胃肠道癌症和妇科癌症最有效的药物[1]，同时也是当前联合化疗中最常用的药物之一[2]。目前，临床上常用的顺铂剂型有粉针剂、冻干剂、注射剂3种类型。由于注射后，顺铂转移进入血液循环的速度快，在癌组织中停留时间很短，很难达到高效、长效的抗癌作用[3-5]。顺铂与其他抗肿瘤药物一样，容易产生肾毒性、骨髓抑制、恶心、呕吐等不良反应。因此，虽然自1969年就已报道顺铂对肿瘤具有强抑制作用，但其剂型仍有待改善以满足临床的需求。聚己内酯(polycaprolactone，PCL)是生物可降解材料，可使药物持续释放数月，是一种性能优良的缓释药物载体材料[6]。将顺铂制成PCL微球，可用于肿瘤的栓塞治疗，使肿瘤区的药物浓度长时间维持在较高水平，降低体循环的药物浓度，提高疗效，降低毒副作用。目前，顺铂微球制剂存在载药率低等缺点，限制其在临床的应用，制备载药率较高的顺铂微球对栓塞微球实现个体化治疗有一定的促进意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 PCL(数均分子量分别为7×104，16.5×104，英国Sigma试剂有限公司)；顺铂(65%Pt，上海麦克林生化有限公司)；聚乙烯醇(PVA，醇解度87.0～89.0 mol%，黏度20.5～24.5 mPa·s，上海阿拉丁试剂有限公司)；二氯甲烷(DCM)；N，N二甲基甲酰胺(DMF)；二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；透析袋(截留分子量2 000，上海生工生物工程有限公司)。

1.1.2仪器 电子天平(HZK-FA110，福州华志科学仪器有限公司)；超声仪(KQ-250DE，昆山市超声仪器有限有司)；紫外分光光度计(UV-2450，上海岛津国际贸易公司)；精密增力电动搅拌器(JJ-1)及恒温振荡器(SHA-B)(常州国华仪器有限公司)；钨灯扫描电子显微镜(Quanta 250，美国FEI公司)；XRD衍射仪(DY5261/Xpert3型，美国CEM公司)；偏光显微镜(XP-330C，上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1顺铂微球的制备 采用水包油(O/W)与溶剂挥发相结合的方法制备负载顺铂的PCL微球。准确称取0.180 g PCL，溶于一定量的DCM中后，加入0.018 g顺铂，在超声仪中超声1 min形成均一分散相，然后将此溶液逐滴加到50 mL PVA水溶液中，分散乳化。其中PVA浓度为1.0%～3.5%，分散搅拌速度为500～1 000 r/min。在磁力搅拌下使残余的有机溶剂DCM挥发，固化成球。制得一系列微球(标记为A1～A6及B1～B3，A系列是分子量为16.5万PCL制得的微球，B系列是分子量为7万PCL制得的微球)。

1.2.2载药量和包封率的测定 由于顺铂是以固体的形式包含于PCL，需将顺铂全部溶出，再测定其含量，故绘制顺铂-DMF标准曲线来测定其载药率和包封率：精密称取0.01 g顺铂，用DMF配置成2.000 mg/mL的标准溶液，随后用DMF稀释成一系列浓度(0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8及1.0 mg/mL)，以DMF液为空白溶液，于紫外光谱仪310 nm处测吸光度，以浓度对吸光度作标准曲线，从回归方程(1)可知，在0.01～1.0 mg/mL范围内，标准曲线线性关系良好。取20 mg干燥后的微球，溶于2 mL的DMF，定容。于310 nm处测吸光度，根据回归方程(1)计算出顺铂的含量，并计算载药率和包封率。

A=0.564 2C+0.002

(1)

(R2=0.9994，其中C为顺铂在介质中的浓度，A为吸光度，R2为相关系数)

1.2.4载药微球中药物的存在形式 取适量样品，用红外压片机压片，再把样品转移到特制的载玻片上，采用X射线衍射法考察顺铂在微球中的结构。仪器参数：扫描范围2θ=5°～70°，扫描速度4°/min。

1.2.5微球的体外释放测试 顺铂-DDTC标准曲线的绘制[7]：精密称取0.01 g的顺铂，用0.9%生理盐水配置成1.000 mg/mL的标准溶液，随后用0.9%生理盐水稀释成一系列浓度(0.1，0.5，1.0，10.0，15.0，25.0，50.0及100.0 μg/mL)，然后各取1.00 mL，分别加入10%碱性DDTC溶液1.00 mL，沸水浴加热10 min使顺铂与DDTC形成螯合物，冷却后加入5 mL氯仿，37 ℃恒温振荡10 min，2 000 r/min离心10 min，分离氯仿层，以氯仿为空白溶液，于347 nm处测吸光度，以浓度对吸光度作标准曲线，从回归方程(2)可知，在0.1～100 μg/mL范围内，标准曲线线性关系良好。准确称取顺铂微球30 mg，并量取5 mL 0.9%的NaCl溶液加入透析袋中(截留分子量2 000)，然后将透析袋放入15 mL的0.9%的NaCl溶液中，在避光条件下，于37 ℃恒温振荡器往复振荡，每隔一段时间取出所有释放介质，并替换新鲜等量的0.9%的NaCl溶液。取所释放溶液1 mL按上述方法进行螯合处理，以氯仿为空白溶液，于347 nm处测吸光度，根据方程(2)计算出微球顺铂释放量。

A=0.011 7C+0.003 4

(2)

(R2=0.999 3，其中C为顺铂-DDTC螯合物在介质中的浓度，A为吸光度，R2为相关系数)

2 结 果

2.1PVA浓度及PCL分子量对微球载药率及包封率的影响 按表1设计的乳化条件制得微球并测定载药率及包封率。在其他条件相同时，高分子量的PCL制得微球的载药率和包封率均高于低分子量PCL制得的微球，且无论PCL分子量的高低，载药率都随着PVA浓度的增大而减小。当PVA浓度较低时，分子量大的PCL包载药物乳化成球过程中，有少部分PCL未能成球，形成絮状物。

表1 不同PCL分子量和PVA浓度条件下的微球载药率和包封率

2.2搅拌速度对微球载药率及包封率的影响 基于表1中分子量为16.5万的聚合物的载药率及包封率较高，选用该分子量的PCL为载体，研究搅拌速度对微球载药率和包封率的影响，结果见表2。当其他变量固定时，载药率随着搅拌速度增大而降低，而药物的包封率随着搅拌速度的增大先增大后减小。研究发现，当搅拌速度低于650 r/min时，会产生部分PCL絮状沉淀，使微球产量减少。当搅拌速度为800 r/min时，分散相能很好地分散于连续相中，成球效果好，载药率与包封率均较高。

表2不同搅拌速度下的微球载药率和包封率

Tab 2The drug encapsulation and loading efficiency of microspheres on different stirring rate

样品搅拌速度(r·min-1)PVA浓度%载药率%包封率%A45003.510.9±0.350.7±2.0A56503.59.98±0.757.7±0.7A38003.57.81±0.574.9±0.2A610003.54.87±2.147.2±0.1

2.3微球表面形态及粒径 图1为分子量为16.5万的PCL制得的一系列微球(A1～A6)的偏光显微镜图，其粒径大小见表3，可见微球的粒径随PVA浓度和搅拌速度的增大而减小。当PVA浓度为3.5%、乳化搅拌速度为800 r/min时，所制得的微球较其他条件下制得的均一，粒径大小为50.4 μm。通过扫描电镜观察微球表面形貌，可见微球表面光滑，粒径较为均一，与偏光显微镜下的观察结果一致。图2为A3与A6微球的扫描电镜图。

表3 不同条件下制得的微球的粒径

2.4XRD结果 载顺铂PCL微球的X射线衍射检测结果如图3。顺铂在10°～50°范围内呈现较多结晶特征衍射峰；空白微球在20°～30°出现了PCL的半结晶性特征峰[8]；载药微球中保留了顺铂和PCL各自的晶型峰。

2.5不同粒径微球的体外释放评价 选择粒径分别为50.4 μm(A3)，107.5 μm(A4)及36.5 μm(A6)的3种具有代表性的微球进行药物体外缓释实验。由图4可知，3种微球突释现象不明显，均具有较好的缓释性能，并且药物的释放速度随粒径增大而减小。

2.6药物释放动力学研究 不同粒径大小微球的顺铂释放过程满足Fickian扩散定律[9]，即药物的累积释放率与时间的开方成正比：

微球的PCL分子量均为16.5×104，A1～A6的搅拌速度及所用PVA浓度见表3.

微球的PCL分子量均为16.5×104，PVA浓度均为3.5%，搅拌速度A3，A6分别为800，1 000 r/min.

图3 顺铂、聚己内酯空白微球及顺铂-聚己内酯微球的XRD图

n=3.

其中，Mt/M0为药物累积释放分数，t为释放时间，k为释放常数。对t1/2进行线性拟合，斜率即为k值，拟合度R2越接近于1表示线性越好，越符合Fickian扩散定律[10]。根据体外释放实验结果求得的k值见表4，k值越大表示药物释放速度越快。

表4顺铂微球体释放量动力学数据

Tab 4Release kinetic data of cisplatin from microspheresinvitro

样品k/(%·d-1)R2A310.0380.9542A47.9030.9696A613.4290.9603

3 讨 论

顺铂虽是一种广谱抗癌药，但因其水溶性差、仅能注射给药并伴有严重的肾及神经毒性等缺点而限制了其应用[11]。顺铂微球制剂研发中，乳化条件在很大程度上影响微球的粒径、载药率和包封率，从而影响微球的缓释性能。本研究探讨了载体的分子量、乳化剂浓度、乳化搅拌速度3个影响因素，并研究了PCL对顺铂的缓释性能。结果发现，用高分子量的PCL制得的微球的载药率与包封率均比用低分子量的PCL制得的微球大得多，分析原因可能是分子量大的PCL形成的分散相黏度大，利于药物的粘结与包载。PVA浓度较低时，分子量大的PCL包载药物乳化成球过程中有少部分PCL未成球而形成絮状物，使得PVA低浓度下成球的载药微球具有较高的载药率，但包封率下降；同样，乳化搅拌速度偏低时，由于搅拌器对有机相剪切力减弱，乳化效果变差，也易形成部分PCL絮状沉淀，使微球产量减少。

本研究测定微球的载药率和包封率所用的标准曲线与体外释放所用的标准曲线不同，主要原因在于测定载药率和包封率时需将微球中的顺铂全部萃取出，由于顺铂和PCL都易溶于DMF，且PCL在310 nm处无吸收，故绘制顺铂-DMF标准曲线来测定其载药率和包封率；而测定体外释放时，顺铂从微球中释放量低，顺铂-DMF曲线不能满足其检测要求，用DDTC络合顺铂可提高其紫外吸光值，使检测更灵敏，故绘制顺铂-DDTC曲线来提高检测的精确性，保证实验结果的可靠性。

XRD显示载药微球中保留了顺铂和PCL各自的晶型峰，说明顺铂是以结晶态而非无定型态分布在载药微球中，且载体PCL仍存在结晶区。顺铂在微球中以结晶态存在，使得顺铂的溶出速度较慢，且PCL仍保持有结晶区部分，顺铂无法从载体结晶区扩散，只能通过PCL无定形区扩散释放，进一步减缓了顺铂的释放速度[12]，这与体外释放检测中无突释现象相吻合，药物释放数据分析表明，顺铂释放过程以扩散释放为主，释放速度与微球粒径大小有关，粒径大，释放速度慢。而微球粒径大小受制备条件影响，因此研究乳化条件具有重要意义。

该研究中当PVA浓度为3.5%、乳化搅拌速度为800 r/min时，采用高分子量的PCL负载顺铂，可制得粒径较为均一、大小为54 μm的顺铂微球，载药率达7.8%、顺铂包封率达75%。有望通过PCL包载顺铂从而提高顺铂的药效、降低其毒副作用，为今后制备更有效的顺铂微球制剂提供一定的参考价值。