玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分的含量测定研究

马国萍，陈 丹，朱仙慕，刘秀棉，洪丽婷，陈 思, 陈 红

玳玳(CitrusaurantiumL.vardaidaiTanaka)芸香科柑桔亚属植物，为酸橙变种，属药食同源中药[1]。玳玳果黄酮降脂提取物是课题组运用已获国家发明专利授权的制备工艺制成的总黄酮含量稳定>80%且具有良好的降血脂和抗氧化作用的中药有效部位提取物[2-5]。研究表明，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷等为其体内主要效应组分[6-7]。为有效控制玳玳果黄酮降脂提取物的质量，本研究拟建立HPLC外标法同时测定玳玳果黄酮降脂提取物中4个主要效应组分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷含量的测定方法，为完善并提升玳玳果黄酮降脂提取物的内控质量标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试药 新橙皮苷对照品(批号110722-201109，中国食品药品检定研究院)；柚皮苷对照品(批号111857-201101，中国食品药品检定研究院)；橙皮内酯水合物(纯度为98.9%，实验室自制)、枳属苷(纯度为98.7%，实验室自制)；玳玳果黄酮提取物(批号20171015，20171114，20171201，自制)；水为超纯水；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.1.2仪器 Waters2695高效液相色谱仪；Waters2996检测器；Empower3色谱工作站；AR2140 万分之一电子天平，XS205 十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1色谱条件与系统适用性实验 色谱柱250-4 Lichrocart C18(4.0 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.2%醋酸水溶液，程序洗脱；检测波长284 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2供试品溶液的制备 精密称取玳玳果黄酮降脂提取物约10 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀即得。

1.2.3对照品溶液的制备 分别精密称取新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷对照品适量，加甲醇溶解，制得质量浓度分别为1.510，1.036，0.275及0.328 mg/mL的对照品溶液。

1.2.4阴性对照品溶液的制备 取缺玳玳果黄酮降脂提取物的空白溶剂，按“1.2.2”项下同法操作即得。

1.2.5专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、阴性对照溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.6标准曲线制备及线性关系考察 精密量取新橙皮苷对照品溶液 100，305，655，1 005，1 500，2 000 μL，柚皮苷对照品溶液100，250，400，800，1 500，2 000 μL，枳属苷对照品溶液10，30，50，70，100，200，250 μL，橙皮内酯水合物对照品溶液40，70，100，200，400，450 μL，依次对应，分别放置于2 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度摇匀，即得4个效应组分系列混合对照品溶液。分别精密吸取效应组分系列混合对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，新橙皮苷、柚皮苷、枳属苷、橙皮内酯水合物对照品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7精密度试验 精密吸取同一份混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，记录各效应组分峰面积，分别计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8重复性试验 分别精密称取同一批(批号20171114)玳玳果黄酮降脂提取物粉末约10 mg，6份，按“1.2.2”“1.2.5”项下同法操作，测定，记录各效应组分峰面积值，计算含量及RSD。

1.2.9稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h，按“1.2.2”“1.2.5”项下同法操作，测定，分别记录新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷峰面积，分别计算RSD。

1.2.10加样回收率试验 分别精密称取已知含量的玳玳果黄酮降脂提取物约5 mg(批号20171114)6份，分别精密加入适量对照品溶液(每1 mL含新橙皮苷1.510 mg，柚皮苷1.036 mg，橙皮内酯水合物0.275 mg，枳属苷0.328 mg)，按“1.2.2”“1.2.5”项下同法操作，测定，计算新橙皮苷、柚皮苷、枳属苷、橙皮内酯水合物的平均回收率及RSD。

1.2.11样品含量测定 取3批玳玳果黄酮降脂提取物(自制，批号20171015，20171114，20171201)，分别精密称取提取物粉末约10.0 mg，每批3份，按“1.2.2”“1.2.5”项下同法操作，测定，外标法计算含量。

2 结 果

2.1专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，注入液相色谱仪。实验结果表明，各效应组分色谱峰分离良好，阴性对照无干扰(图1)。

a：混合对照品； B：阴性对照； C：玳玳黄酮提取物. 1：柚皮苷；2：新橙皮苷；3：橙皮内酯水合物；4：枳属苷.

2.2标准曲线制备及线性关系考察 新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷分别在76.365～1 491.482 μg/mL，49.155～1 024.283 μg/mL，5.134～61.151 μg/mL，1.771～40.962 μg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系。4个效应组分标准曲线回归方程及线性范围见表2。

表2 标准曲线测定结果

2.3精密度试验 同一份混合对照品溶液，连续进样6次后测得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷峰面积的RSD分别为0.48%，0.34%，0.92%及1.09%，表明仪器精密度良好(表3)。

表3 精密度试验结果

RSD：相对标准偏差.

2.4重复性试验 同一批号20181114的玳玳果黄酮降脂提取物粉末6份，测得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷平均含量分别为372.7 mg/g(RSD=2.26%，n=6)，294.3 mg/g(RSD=2.44%，n=6)，26.70 mg/g(RSD=2.35%，n=6)，15.00 mg/g(RSD=2.49%，n=6),表明该方法重复性良好(表4)。

表4 重复性试验结果

RSD：相对标准偏差.

2.5稳定性试验 同一份供试品溶液分别于0，2，4，6，8，12，24 h测得峰面积，计算新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷各效应组分RSD分别为0.42%，0.85%，1.95%及1.29%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好(表5)。

2.6加样回收率试验 玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷加样回收率结果均符合准确度要求(表6)。

2.7样品含量测定 3批玳玳果黄酮降脂提取物外标法测定计算得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷含量(表7)。

表5 稳定性考察结果

RSD：相对标准偏差.

表6 加样回收率试验结果

RSD：相对标准偏差.

表7 样品含量测定结果

n=3. RSD：相对标准偏差.

3 讨 论

玳玳果黄酮降脂提取物是课题组运用已获国家发明专利授权的制备工艺制成的总黄酮含量稳定大于80%且具有良好的降血脂和抗氧化作用的中药有效部位提取物，由其制备的提取物具有多组分群和多靶点作用的特点。课题组研究表明，其体内主要效应组分有新橙皮苷、柚皮苷、枳属苷、橙皮内酯水合物，其中特征活性成分新橙皮苷、柚皮苷占总黄酮含量60%以上。为有效控制玳玳果黄酮降脂提取物的质量，针对有效部位提取物具备多组分群的特点，通过建立HPLC外标法同时测定玳玳果黄酮降脂提取物活性成分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷的含量，建立可实现多指标组分群质量控制的定量分析方法。

本研究比较了不同柱温(20，25，30，35 ℃)及进样量(10，20 μL)对色谱峰分离的影响。结果表明，柱温20 ℃时，各成分色谱峰分离效果较差且未完全出峰；柱温25 ℃时，3号色谱峰出现双峰，分离度受影响；柱温30℃时，各成分峰达到完全分离且峰形良好；柱温35 ℃时，成分峰分离良好，但出现色谱峰飘移现象；当进样量10 μL时，各成分峰在22 min内出峰，分离良好，基线稳定；当进样量20 μL时，会出现前沿峰。故本研究选取柱温30 ℃、进样量10 μL的进样条件，基线平稳，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷色谱峰达到完全分离。

本研究建立采用HPLC法同时测定玳玳果黄酮降脂提取物中4个主要效应组分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷含量的测定方法，经方法学考察，该方法精密度、重复性、稳定性良好，专属性强，准确度高，可用于玳玳果黄酮降脂提取物多指标效应组分含量测定的质量监控。