沈阳地区孕晚期妇女携带B群链球菌不同血清型的调查研究

高爽，孙晓娟，柳中洋，丛桂敏，阮强

B 群链球菌（group B streptococcus，GBS）又称无乳链球菌，GBS感染易导致早产、胎膜早破、胎儿生长受限等一系列母婴不良结局，是孕产妇和新生儿最常见的感染致病菌，有研究报道称GBS是发展中国家新生儿死亡的主要原因[1-3]。由于妊娠期妇女免疫功能相对较低，孕妇GBS携带率较高，美国和北欧等国家孕妇GBS携带率约为15%～35%[4]，国内孕妇GBS携带率约为2.4%～10.1%。GBS表达的多糖荚膜是很重要的一个毒力因子，也是疫苗研发的一个关键目标。根据GBS细胞壁上特异性荚膜多糖的化学组成不同分为10种不同的血清型，即Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ[5]，其中Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型致病力较强。也有研究发现存在部分不同于任何已知血清型的非分型GBS菌株，统称为血清型NT。而我国各个GBS血清型在孕妇GBS携带群体中分布的数据不足，对于不同血清型的耐药差异更是鲜有报道。本课题组对沈阳地区孕妇携带GBS群体进行血清型调查分析，旨在了解沈阳地区不同GBS血清型的流行情况及各型别间的耐药差异，为临床科学合理的诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取2016年5月—2017年8月于沈阳市妇婴医院（我院）产科就诊的19 122例孕晚期妇女。因为GBS在直肠和阴道均可定植，为避免漏检，每位患者均采集阴道分泌物和直肠标本，并经细菌鉴定为GBS阳性（其中有一个标本为阳性即诊断为GBS阳性），以居住沈阳地区3年以上的孕妇携带的GBS纯培养菌株为标本。

1.2 细菌鉴定标本采集及分离培养严格遵循《全国临床检验操作规程》，接种于5%哥伦比亚羊血琼脂平板后置于35℃培养箱培养18～24 h。分别以2016年CLSI M00-S24和2017年CLSI M00-S27美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准为依据，采用迪尔公司DL96全自动细菌分析仪进行菌株鉴定与药敏试验。

1.3 质控质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923），均由中国药品生物制品鉴定所提供。

1.4 引物设计及合成分别以GBS血清型Ⅰa（GeneBank accession No.AB028896.2）、 Ⅰ b （GeneBank accession No.AB050723.1）、Ⅱ （GeneBank accession No.AY375362.1）、Ⅲ（GeneBank accession No.AF163833.1）、Ⅳ（GeneBank accession No.AF355776.1）、Ⅴ（GeneBank accession No.AF349539.1）、Ⅵ（GeneBank accession No.AF337958.1）、Ⅶ（GeneBank accession No.AY376403.1）、Ⅷ（GeneBank accession No.AY375363.1）和Ⅸ（GeneBank accession No.EF157290.1）为参考株，应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计用于GBS不同血清型筛选的特异性聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物。设计的引物见表1。引物由Invitrogen公司合成。

表1 本研究中的引物情况

1.5 GBS菌株基因组提取及PCR实验采用TaKaRa试剂盒（TaKaRa Minibest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0），严格按照操作说明进行GBS菌株基因组的提取，PCR所需试剂均购自TaKaRa公司，以提取的GBS基因组为模板，美国PE公司的DNA Thermal Cycke480循环仪进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。

1.6 GBS菌株基因测序应用琼脂糖凝胶电泳筛选出具有目的条带的PCR扩增产物，进行基因测序，由Invitrogen公司完成。

1.7 统计学分析采用世界卫生组织（WHO）推荐的WHONET 8.4软件进行细菌耐药率分析；应用GeneBank软件进行基因序列分析；数据统计分析则采用SPSS 22.0软件，定量资料用均数±标准差（x±s）表示，定性资料用株数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕晚期妇女GBS携带率19 122例孕晚期妇女的生殖道和直肠分泌物标本共鉴定出GBS阳性者572例，GBS携带率为3.0%。其中，筛选源自沈阳地区的GBS纯培养菌株共计251株，孕妇年龄为21～42 岁，平均（31.0±4.8）岁。

2.2 GBS血清型鉴定GeneBank序列分析软件对比分析GBS菌株发现，251株GBS血清型以Ⅰa为主，占44.22%（111/251）；其次为Ⅴ型、Ⅲ型和NT型，依次占 38.65%（97/251）、13.94%（35/251）和3.19%（8/251）。

8株NT血清型GBS菌株通过序列分析比较发现，血清型NT和Ⅴ具有高度同源性，仅有一个碱基位点存在差异。见图1。

图1 血清型V和NT序列比较

2.3 不同血清型GBS菌株耐药情况及比较Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ和NT 4个血清型的GBS菌株对氨苄西林、青霉素、万古霉素、利奈唑胺和美罗培南均敏感，尚未检测出耐药株；对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四环素的耐药率较高。结果显示，红霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四环素对4个血清型GBS菌株耐药率的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。血清型Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四环素4种药物的耐药率差异有统计学意义（P＜0.05），即同一血清型对这4种药物的耐药率有显著差异，而血清型NT对不同药物的耐药率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同血清型的GBS菌株对常用抗生素的耐药情况[株数（%）]

2.4 携带不同血清型GBS菌株患者胎膜早破发生率的比较携带Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ和NT 4个不同血清型GBS菌株的孕晚期妇女胎膜早破的发生率分别为23.42%（26/111）、34.28%（12/35）、10.31%（10/97）和25.00%（2/8），差异有统计学意义（χ2=11.128，P=0.011)。

3 讨论

3.1 GBS携带率的地域分布研究表明GBS在女性生殖道和直肠的携带率为15%～35%[4]，但10%～30%的孕妇可能会出现无症状的GBS阴道、直肠定植，且会因种族和地域的差异而不同[6]。Kwatra等[7]的研究结果显示，非洲地区人群GBS携带率最高，为18.1%～26.7%；其次为美国（16.7%～22.7%）、欧洲地区（16.1%～22.0%）。2010年，美国疾病控制与预防中心（CDC）制定了《围生期GBS预防指南》，提出所有35～37孕周妇女应进行GBS筛查，阳性患者需预防性治疗，以减少新生儿GBS的感染风险[8]。在中国，虽然有关于GBS定植与感染耐药性的相关报道，但尚缺乏多中心、大样本的研究数据。目前，常规的孕检项目也未包括妊娠期妇女GBS筛查。有关GBS感染的文献报道的携带率差异较大。本研究发现沈阳地区GBS携带率仅为3.0%，而北京地区的妊娠妇女GBS携带率为3.4%～17.6%[9-10]，上海地区为3.7%[11]，广州地区为9.1%～19.1%[12]，江苏地区为4.1%～11.0%[13-16]，浙江地区为6.9%[14]。表明GBS携带率地域差异明显，也可能由于各研究中所使用的GBS筛查方法及样本量的不同导致。

3.2 GBS血清型的地域分布目前文献中有关各地区GBS血清型的调查更加缺乏。本研究对沈阳地区251株GBS纯培养菌株采用PCR方法进行血清型鉴定，结果显示沈阳地区GBS感染的血清型以Ⅰa（44.22%）和Ⅴ（38.65%）为主，其次为Ⅲ（13.94%）。虽然传统的细菌培养方法仍为GBS检测的金标准，但存在检验时间长、敏感度低的缺点，使得GBS筛选的阳性率降低。近年来随着分子生物学技术的发展，PCR可快速、准确地检测GBS，但也存在假阳性的问题。2010年《围生期GBS预防指南》也明确指出PCR可以用于GBS的筛查工作，相关文献也证实PCR对于筛查GBS具有准确、高效的特点[10,17]。本研究中为避免PCR检测方法存在假阳性的问题，PCR扩增的所有片段都进行基因测序分析。Ippolito等[18]对全世界多个国家和地区妊娠期妇女GBS血清型的大规模数据分析显示，不同地区GBS血清型的差异较大，亚洲人种以Ⅲ型最多，可达29.83%，其次是Ⅴ（17.49%）、Ⅰb（14.07%）、Ⅰa（11.24%），尚缺乏中国的相关数据。研究结果还显示缅甸和印度人群GBS的血清型均以Ⅰa型为主，其次是Ⅲ型和Ⅴ型；泰国GBS血清型以Ⅴ型为主，其次是Ⅰa型和Ⅲ型，均表明亚洲地区的血清型分布存在明显的地域差异。Johri等[19]的研究表明中国妊娠期妇女GBS感染主要以Ⅰa（18%）、Ⅱ（36%）和Ⅲ（26%）为主。上海的一项多中心研究结果则表明该地区妊娠期妇女GBS感染以Ⅲ、Ⅴ和Ⅰa型为主，达79.7%[20]。本研究中辽宁地区GBS血清型分布的研究结果与其研究结果较一致，但以血清型Ⅰa为主，表明GBS血清型的分布存在明显的地域差异。有必要对我国其他地区进行大规模的GBS血清型分布调查，以明确不同地区GBS血清型的分布差异，对于GBS疫苗的研发及防治具有重要意义。本研究发现一种新的血清型，与血清型Ⅴ同源性最高，仅存在1个碱基位点的差异，暂命名为血清型NT。Slotved等[21]也曾发现1个与血清型Ⅴ同源性较高的新型GBS，有6个碱基位点的差异，命名为血清型Ⅸ。

3.3 GBS不同血清型的耐药差异分析本研究对GBS不同血清型的菌株进行耐药性差异分析。结果显示，GBSⅠa、Ⅴ、Ⅲ和NT 4个血清型对青霉素、氨苄西林、美罗培南、利奈唑胺和万古霉素敏感率均为100%。因为青霉素和氨苄西林具有不良反应小、对母婴危害程度低的特点，所以目前仍可将其作为孕产妇及新生儿GBS治疗的首选药物[22]。研究还发现这4个血清型对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四环素具有一定的耐药性，但4个血清型之间的耐药性无明显差异。而血清型Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ分别对红霉素、左氧氟沙星、克林霉素和四环素之间的耐药率有显著差异。Church等[23]研究发现28%的GBS感染患者预防性使用抗菌药物是无效的。本研究发现的耐药差异可能解释了为什么预防应用抗菌药物对于某些GBS感染无效，而这势必会增加围生期的感染发生风险。

3.4 携带不同GBS血清型的孕晚期妇女胎膜早破的差异性分析本研究还发现携带不同血清型的孕晚期妇女胎膜早破的发生率差异有统计学意义，以携带血清型Ⅲ的发生率最高，为34.28%，其次为NT（25.00%）、Ⅰa（23.42%）和Ⅴ（10.31%）。唾液酸是荚膜多糖的共有结构，是GBS一个重要的毒力因子，不同GBS血清型唾液酸的含量不同，毒力也不同[3]。其中以血清型Ⅲ唾液酸的含量最高，因此毒力也最强，这可能是血清型Ⅲ导致胎膜早破高发生率的重要原因。胎膜早破一方面会使胎膜对羊膜腔的屏障作用消失，增加绒毛膜羊膜炎和孕妇产褥感染的发生风险；另一方面可引起早产、胎儿窘迫等不良结局的发生。阴道、直肠等处的GBS可上行感染胎膜，引起胎膜局部张力下降，导致胎膜早破的发生。GBS对绒毛膜的穿透力和吸附力均较强，容易导致绒毛膜羊膜炎的发生[24]。10种GBS血清型以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型致病力最强。本研究中以携带血清型Ⅲ孕晚期妇女胎膜早破的发生率最高，也再次证明血清型Ⅲ的毒力较强。

综上所述，应当重视孕晚期妇女GBS的筛查工作，进而了解GBS不同血清型的临床特点和耐药情况，采取恰当的措施，因型施治，为GBS感染的预防、筛查和科学诊疗提供依据；了解不同地区GBS血清型的分布情况，对于GBS疫苗的研发工作具有重要意义。