玉溪、许昌烤烟烟叶中淀粉酶基因的表达及酶活性分析

翟 妞，徐国云，郑庆霞，何声宝，张 慧，刘萍萍，许亚龙，陈千思，王 晨，周会娜*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2.国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

淀粉是烟叶在生育期积累的主要碳水化合物，在鲜烟叶中的含量高达30%～40%［1］。淀粉含量是烟叶质量评价的常规指标之一，其水解产物含量的高低可直接影响烟叶的感官特性，同时还可通过美拉德反应产生一系列烟叶香味成分［2］。烤烟烟叶在生育期需积累一定的淀粉，但烤后烟叶中残留的淀粉则会影响烟叶的外观和品质［3］，因此要尽可能将其水解。在调制过程中，烟叶的大部分淀粉能被淀粉酶水解成糖类［4-5］，通过添加外源淀粉酶可使淀粉充分水解［2-3,6］。烟草中的淀粉酶主要为α-淀粉酶和β-淀粉酶，普遍存在于叶肉细胞中，能断裂淀粉中的糖苷键［7］。

研究发现在云南、河南两地，成熟期烟叶中的淀粉含量差异不大，但调制后云南烟叶中的糖含量明显高于河南［8-9］。还发现在烘烤过程中，淀粉、可溶性糖与淀粉酶的活性高度相关［10］。本实验室人员前期研究发现，不同年份鲜烟叶中的淀粉含量存在较大波动，云南鲜烟叶中的淀粉含量并不总是高于河南，但两者烤后烟叶之间的糖含量差异则较为稳定，表明高含糖量的云南烟叶可能与淀粉积累多、降解少有关（数据未发表）。鉴于此，以河南许昌和云南玉溪成熟期烤烟中部鲜烟叶为研究对象，通过分析表达谱芯片中与淀粉降解相关的差异表达基因并进行实时荧光定量PCR（qPCR）验证，进一步检测淀粉酶活性、淀粉和总糖含量，旨在了解云南、河南两地烟叶中糖含量差异的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

K326 采集于云南玉溪江川，中烟100 采集于河南许昌襄县。采集年份为2013 和2018 年。上午10 点采集成熟期第10 叶位叶片（从上往下），立即冷冻于液氮中，-80 ℃保存。

1.1.2 试剂

植物RNA 提取试剂盒（货号：RN38）购自北京艾德莱生物技术有限公司；反转录试剂盒（货号：RR047A）购自宝生物工程（大连）有限责任公司；荧光定量PCR 试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master（货号：4913914001）购自美国Roche公司；蛋白定量试剂盒PierceTMBCA Protein Assay Kit（货号：23225）购自美国Thermo 公司；α-淀粉酶活性检测试剂盒（货号：A081647-S）和β-淀粉酶活性检测试剂盒（货号：A09215-S）购自上海晶抗生物科技有限公司。其他常规试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司分析纯试剂。引物由生工生物（上海）工程有限责任公司合成。

1.1.3 仪器

PL-602L 电 子 天 平（瑞 士Mettler Toledo 公司）；电子天平MS105（瑞士Mettler Toledo 公司）；冷冻台式离心机5424R（德国Eppendorf 公司）；超声波破碎仪VCX130（美国Sonnics 公司）；超微量分光光度计Nanodrop 2000（美国Thermo 公司）；实时荧光定量PCR 仪LightCycler®96（美国Roche 公司）；酶标仪SpectraMax plus 384（美国MD 公司）；烘箱FD115（德国Binder 公司）；连续流动分析仪AA3（英国Seal 公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟叶cDNA 制备

将烟叶在液氮中充分研磨后，按照植物RNA提取试剂盒说明书进行RNA 提取。利用超微量分光光度计检测RNA 质量，RNA 浓度≥50 μg/mL、OD260/OD280在1.8～2.0 之 间。将RNA 反 转 录 成cDNA，用于qPCR 分析。反转录体系和反应条件参考张慧等［11］方法。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）

qPCR 扩增体系：10 μL 2×SYBR Green Master，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，2 μL 稀释10 倍的反转录产物，ddH2O 补至20 μL。

qPCR 反应 条 件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃15 s，40 个 循 环；95 ℃5 s，65 ℃1 min，以0.1 ℃/s 升温至97 ℃。β-actin 为内参基因，每个基因各重复3 次。根据CT值计算基因的变化倍数，具体参考张慧等［11］方法。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 烟叶总蛋白的提取及定量

将保存于-80 ℃的烟叶样品在液氮中充分研磨，置于1.5 mL EP管液氮预冷后，取0.1 g加入1 mL提取缓冲液NE。涡旋振荡混匀后，冰上静置1 h。5 000 r/min 离心20 min 后，取上清液，即为蛋白提取液。

取10-1倍的蛋白提取液，按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。根据标准曲线、样品吸光值得到蛋白含量。

蛋白浓度（μg/μL）=［蛋白含量/稀释液总体积］×稀释倍数。

蛋白 提 取NE 缓 冲 液：20 mmol/L Hepes（pH 7.5），40 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF。

1.2.4 淀粉酶活性的检测

同一试验田采集6 份烟叶样品，每份样品重复3 次。将每份样品的蛋白提取液按照α-和β-淀粉酶活性检测试剂盒说明书进行检测，并对结果进行T 检验。

α-或β-淀粉酶活性（U/μg 全蛋白）=样品的活性浓度×上样体积/上样蛋白总量。

1.2.5 烟叶总糖、淀粉含量的检测

同一试验田采集6 份烟叶混合样品，作为6 次重复。采用YC/T 159—2002［12］方法测定烟叶总糖含量（质量分数）；采用YC/T 216—2013［13］方法测定烟叶淀粉含量（质量分数）。对结果进行T检验。

1.2.6 基因芯片分析

芯片制备由国家烟草基因研究中心和美国Affymetrix 公司完成，具体芯片信息参照“烟草SNP 芯片研制及标准、典型表达图谱绘制”的技术报告（数据未公开）。芯片检测和数据分析由北京博奥生物有限公司和国家烟草基因研究中心完成。

使用R 语言affy 芯片数据分析包中的rma 函数对芯片进行标准化，然后对典型香型烟草中玉溪和许昌样品进行分组并使用T 检验进行差异显著性分析，利用R 语言中p.adjust 函数对T 检验结果中的P 值进行Bonferroni 矫正，选取玉溪、许昌两地烟叶中表达差异倍数大于2 的基因，矫正后P＜0.05 为差异基因。

2 结果与分析

2.1 玉溪、许昌烟叶中淀粉和总糖含量分析

分析2013 年许昌、玉溪成熟期烤前烟叶中淀粉和总糖含量（图1），发现玉溪、许昌烟叶中淀粉含量分别为33.00%、35.00%，二者没有显著差异。而总糖含量，玉溪烟叶（2.10%）明显低于许昌烟叶（3.20%）。在全国烟叶质量与品种试验数据库（http://10.6.0.81/）中，2013 年玉溪、许昌烤后烟叶淀粉含量分别为5.65%、4.16%，总糖含量分别为36.46%、20.6%，烤后烟叶中总糖含量玉溪明显高于许昌。推测在烟叶成熟到烘烤过程中，淀粉降解是否充分对烤后烟叶中的总糖含量起到关键作用。

图1 玉溪和许昌烟叶中的淀粉和总糖含量Fig.1 Contents of starch and total sugar in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang

2.2 2013 年玉溪、许昌烟叶中淀粉降解相关基因的筛选及表达量验证

在玉溪和许昌成熟期中部烟叶2013 年的表达谱芯片中，涉及淀粉降解的基因有12 个，分别为Ntab0658590、 Ntab0621070、 Ntab0910040、Ntab0174330、 Ntab0838220、 Ntab0077560、Ntab0169680、 Ntab0811610、 Ntab0938990、Ntab0084570、Ntab0282340 和Ntab0282870。在 玉溪和许昌两地，有4 个表达量有显著差异的淀粉酶基因，分别是2 个α-淀粉酶基因（Ntab0174330 和Ntab0838220）和2 个β-淀粉酶基因（Ntab0811610和Ntab0938990），这4 个基因在玉溪烟叶中表达量较高。qPCR 结果（图2）表明，4 个基因中Ntab0938990 的表达量最高，Ntab0174330 的表达量最低。表达量高低依次为Ntab0938990＞Ntab0838220＞Ntab0811610＞Ntab0174330。

图2 玉溪和许昌烟叶中4 个淀粉酶基因的表达Fig.2 Expressions of four amylase genes in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang

2.3 2013 年玉溪与许昌烟叶中淀粉酶活性的差异

烟草叶片主要通过α-淀粉酶和β-淀粉酶将淀粉降解成糖类。在已报道的文献中［1,4-7］主要关注于α-和β-淀粉酶，鲜有淀粉酶基因的相关报道。基因芯片及qPCR 结果（2.2 节）表明，在玉溪和许昌烟叶中有4 个差异表达的淀粉酶基因。为此，进一步检测玉溪和许昌烟叶中α-和β-淀粉酶的活性。在2013 年，许昌和玉溪成熟期中部烟叶中α-和β-淀粉酶活性结果（图3）表明，两地烟叶中α-和β-淀粉酶的活性变化趋势一致，即均在玉溪烟叶中较高，分别是许昌烟叶的2.6 和2.2 倍。

2.4 玉溪、许昌烟叶中淀粉酶基因表达和活性的年份差异

图3 玉溪和许昌烟叶中α-和β-淀粉酶的活性（2013 年）Fig.3 Activities of α-and β-amylases in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2013)

为分析不同年份间玉溪和许昌烟叶中淀粉酶基因的表达及其酶活性的差异，于2018 年重新对两地烟叶进行α-和β-淀粉酶基因的表达及其酶活性的分析。与2013 年相比，在2018 年玉溪烟叶中，α-淀粉酶基因（Ntab0174330、Ntab0838220）和β-淀粉酶基因（Ntab0811610、Ntab0938990）的表达量明显高于许昌烟叶（图4）。同时检测了两地烟叶样品中α-和β-淀粉酶活性，发现玉溪烟叶中的α-淀粉酶活性（5.10×10-5U/μg 全蛋白）和β-淀粉酶活性（1.50×10-4U/μg 全蛋白）都高于许昌烟叶（4.70×10-5U/μg 全蛋白，1.30×10-4U/μg 全蛋白）（图5）。在全国烟叶质量与品种试验数据库（http://10.6.0.81/）中，2018 年玉溪、许昌烤后烟叶淀粉含量分别为4.10%、4.49%，总糖含量分别为32.18%、24.97%，烤后烟叶中总糖含量玉溪明显高于许昌。综上，两个年份之间，玉溪和许昌烟叶中淀粉酶基因的表达和酶活性以及烤后烟叶中总糖的变化趋势一致。

图4 玉溪和许昌烟叶中α-和β-淀粉酶基因的表达（2018 年）Fig.4 Expressions of α-and β-amylase genes in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2018)

图5 玉溪和许昌烟叶中α-和β-淀粉酶的活性（2018 年）Fig.5 Activities of α-and β-amylases in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2018)

3 讨论

淀粉含量是烟叶质量评价的常规指标之一，淀粉降解产物中糖含量的高低直接影响烟叶的感官品质。从鲜烟叶看，玉溪烟叶中的淀粉含量和许昌没有显著差异，总糖含量玉溪低于许昌；而在烤后烟叶中，玉溪烟叶中的总糖含量明显高于许昌烟叶。对比两地烟叶烤前、烤后的总糖含量，推测玉溪、许昌两地烟叶的淀粉降解存在差异，玉溪烟叶在烘烤过程中淀粉降解较为充分，而许昌烟叶的淀粉降解不太充分。而淀粉酶在淀粉降解过程中起关键作用，玉溪和许昌烟叶在烘烤过程中淀粉降解的差异，可能与两地烟叶中淀粉酶的活性有关。本研究结果证实了这一推论，明确了4个在玉溪和许昌烟叶中表达量具有显著差异的淀粉酶基因，即α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220 和β-淀 粉 酶 基 因Ntab0811610、Ntab0938990。同时检测玉溪和许昌烟叶中的α-和β-淀粉酶活性，结果表明玉溪烟叶中α-和β-淀粉酶活性都高于许昌烟叶。

近年来，烟叶中淀粉酶基因及淀粉酶活性被逐渐关注［14］。通过分析云南玉溪和河南许昌烟叶中淀粉酶活性的差异和淀粉酶基因表达的差异，结合两地烟叶烤前、烤后的淀粉和总糖含量差异，发现淀粉酶在烤后烟叶总糖含量中起着关键作用，而不是烤前烟叶的淀粉积累量。已有研究结果表明，在烟叶烘烤过程中通过添加外源淀粉酶可促使淀粉充分降解［2-3,6］。宫长荣等［15］研究表明，河南烟叶在烘烤过程中β-淀粉酶的活性最高。在后续研究中，可根据本研究结果，以α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220 和β-淀粉酶基因Ntab0811610、Ntab0938990 为目标基因，尤其是β-淀粉酶基因Ntab0938990（在两地中表达量都最高），在烟草中构建超量表达的转基因植株，为分子辅助育种提供材料。

4 结论

①玉溪、许昌两地鲜烟叶中的淀粉含量差异不显著。②4 个淀粉酶基因在玉溪烟叶中的表达量较高，即α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220和β-淀粉酶基因Ntab0811610、Ntab0938990。③玉溪鲜烟叶中的α-和β-淀粉酶活性高于许昌烟叶。两个年份数据表明，玉溪、许昌两地烟叶中的α-和β-淀粉酶活性变化趋势一致。