氯化钙对酸雨胁迫下烤烟叶片表观特征和叶绿素荧光特性的影响

徐宗艺，陈泉印，米 良，黄雨萌，王 月，孙广玉

东北林业大学生命科学学院，哈尔滨市香坊区和兴路26 号 150040

天然降水通常受溶解的二氧化碳影响，其pH一般为5.6 左右［1］。而随着城镇的工业化发展，对化石燃料能源的需求量日益增加，同时燃烧过程中向大气排放氮和硫的氧化物也越来越多，直接导致大气酸沉降增加［2-3］。目前，酸沉降已成为世界三大环境问题之一［3-5］。近年来，随着中国经济的发展，受酸雨湿沉降影响的土地面积逐年扩大，危害越来越严重［6］。长期及过量的大气酸沉降对生态系统及人体健康具有较大的危害性，而在整个生态系统中，植物是酸沉降污染的主要受体［7］。酸沉降会腐蚀植物体表皮、造成植物体内的酶和叶绿素部分失活、膜质过氧化、自由基平衡遭受破坏，植物抵抗环境胁迫的能力降低［4，8-14］。钙不仅是植物必需的矿质营养元素，而且可作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联胞外信号。因此，可以通过稳定细胞壁和细胞膜结构并诱导特定基因的表达来提高植物体的抗逆性［15-18］。通过施加外源钙提高植物抗性的方法已在小麦、玉米、苜蓿、龙眼和番茄等作物，以及水果和蔬菜上得到应用［19-23］。烤烟是我国重要的叶用经济作物，而已有的烤烟在逆境胁迫下的研究主要集中在细胞膜透性、气候斑的形成以及抗病性等方面［24-25］，对烤烟光合机构的研究报道较少，尤其在烤烟受酸雨胁迫后施加外源钙的研究方面尚鲜见报道。为此，以烤烟品种龙江911 为材料，通过检测烟草叶片表观伤害、吸收光能能力、电子传递速率及PSⅡ供体侧、受体侧和反应中心活性，以及检测光合碳同化能力等，研究酸雨湿沉降对植物叶片光合机构造成的伤害，明确在酸雨胁迫条件下施加外源氯化钙的缓解作用，旨在为酸雨频发地区的烤烟栽培管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为龙江911，由黑龙江省烟草科学研究所提供。试验在东北林业大学植物生理实验室酸雨棚中进行。采用传统营养钵育苗，待烤烟幼苗长至4叶1心时，移栽至直径15 cm、高20 cm的培养钵中，每钵定植1 株，以草炭土∶蛭石=2∶1（体积比）的混合物作为培养基质。在温度25 ℃/23 ℃（光/暗）、光照强度400 μmol·m-2·s-1、光周期12 h/12 h（光/暗）、相对湿度75%的人工气候箱中培养，每周浇灌1 次稀释1 倍的Hoagland 营养液。待幼苗长到6 叶1 心时选取长势一致的烟苗进行酸雨处理。

1.2 试验处理

设置模拟酸雨溶液处理组pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 共4 个。依据黑龙江省的酸雨类型并参照有关研究报道［26］，按［SO42-］和［NO3-］比例为1∶3，配制酸雨母液。同时配制电解质母液（pH 7.0），主要离子成分及浓度为31.46 mg/L NaF、26.28 mg/L KCl、74.91 mg/L CaCl2、171.28 mg/L MgSO4和82.27 mg/L NH4Cl。通过稀释1 000 倍电解质母液将酸雨母液酸度调整至pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 的模拟酸雨，以清水为对照（CK）。将制备的测试溶液储存在棕色玻璃试剂瓶中并标记。模拟酸雨采用喷雾法喷洒，用500 mL 园艺喷雾器每天喷1 次，每次对烤烟叶片正反面均匀喷洒至叶尖流下细密的液滴为止，连续喷7 d，在每天7：00—8：00 进行喷洒处理，为避免相互干扰，在不同处理间用塑料薄膜将植株分离，喷洒酸雨后第2 天浇水。

在pH 2.5 处理组烟株叶片出现症状后喷施10 mmol·L-1CaCl2溶液（pH 7.0）。均匀喷施在叶片的正面和背面，喷在叶片上的CaCl2溶液形成细雾状的小液珠欲滴为止。待叶片表面的水分自然蒸发，CaCl2溶液完全被吸收后，再重复喷施1 次，每次喷施量相同。

1.3 测定项目与方法

叶片受害率测定：用目测的方法来评估叶片受害等级，见表1。

叶绿素a 荧光参数的测定：于9：00—11：00 时通过多功能植物效率分析仪（M-PEA，英国汉莎公司）测定每处理组中长势相对一致的烤烟烟苗。将烟苗的第2片完全展开叶（从上往下数）进行30 min的暗适应后，测量叶片的初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、电 子 传递 速率（ETR）、光 合 性 能 指 数（PIABS）；光化学反应集聚能量（ABS/RC），QA氧化还原反应消耗能量（TRo/RC），光化学反应中心捕获的用于电子传递能量（ETo/RC）和光化学反应消耗能量（DIo/RC）。利用脉冲调制式荧光仪（FMS-2，英国汉莎公司）测量经过30 min 暗适应后第3 片完全展开叶的用于光化学反应量子产额（ΦPSII），类囊体膜两侧质子梯度和叶黄素循环介导的量子产额（ΦNPQ），基本的荧光量子产额和热耗散量子产额（Φf，D）以及光化学反应失活热耗散量子产额（ΦNF）。

表1 植株叶片受害等级的划分Tab.1 Damage classification of plant leaves

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel Statistical Package（Microsoft Office Excel，2013）软件进行数据统计分析；采用One-Way ANOVA 分析和t 检验进行处理组与对照组的均值及差异显著性检验，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟叶片表观特性的影响

由图1 可见，不同pH 模拟酸雨湿沉降对烤烟叶片可造成不同程度的伤害。受害症状主要表现为叶缘与叶脉间产生黄棕色和黑褐色不规则的斑块，顶端幼叶卷曲、皱缩。pH 5.5 酸雨处理的叶片无可见性伤害；pH 4.5 酸雨处理的叶片表现出轻微伤害，部分烤烟叶片中出现失绿斑点，受害等级为I；pH 3.5 酸雨处理导致叶片出现局部深红色斑点和坏死斑点，斑点直径约0.2 cm，受害面积约占总叶面积的20%，受害等级为Ⅱ。pH 2.5 酸雨处理造成叶片伤害最为严重，有80%以上的烟苗叶片上有伤斑出现，受害等级为IV。施加外源氯化钙可减少酸雨胁迫对烤烟叶片造成的表观伤害，叶片上失绿斑点减少。

图1 酸雨胁迫下施加外源钙对烤烟叶片表观特性的影响Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on phenotype characteristics of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

2.2 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟叶片Fo、Fm、PIABS和ETR 的影响

图2 表明，模拟酸雨湿沉降处理改变了烤烟幼苗叶片的Fo、Fm、PIABS和ETR。与CK 相比，pH 5.5 处理组的Fo、Fm和ETR 分别增加8.02%、4.39%和5.52%；而pH≤4.5 处理组的Fo、Fm、PIABS和ETR与CK 相比则显著降低，说明重度酸雨抑制了烤烟叶片PSⅡ光化学反应，降低PSII 最初光能转换效率以及电子传递速率，抑制光合作用的原初反应过程。而在酸雨胁迫下喷施氯化钙溶液处理组叶 片 的Fo、Fm和PIABS显 著 增 加，CK 和pH 5.5 时ETR 增加不明显，pH≤4.5 时ETR 增加显著，说明烤烟叶片喷施外源钙能够增加PSⅡ反应中心的活性。

2.3 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟叶片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影响

图2 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟叶片Fo、Fm、PIABS和ETR 的影响Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on Fo，Fm，PIABS and ETR of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

图3 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟幼苗叶片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影响Fig.3 Effects of exogenous CaCl2 on ABS/RC，DIo/RC，TRo/RC and ETo/RC of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

模拟酸雨湿沉降处理显著提高了烤烟幼苗叶片的ABS/RC，DIo/RC 和TRo/RC，且酸雨pH越低，增加幅度越明显，见图3。图3 表明，酸雨胁迫减少了烤烟叶片PS Ⅱ反应中心的数量，而剩余光化学反应集聚的能量和QA氧化还原反应消耗的能量增加。在酸雨胁迫下，pH≥3.5 时施加外源氯化钙后烤烟叶片DIo/RC显著增加。其中CK、pH 5.5、pH 4.5 和pH 3.5处 理 组 分 别 增 加17.32%（P＜0.05）、6.64%（P＜0.05）、6.48%（P＜0.05）和8.92%（P＜0.05），说 明施加外源钙可增加烤烟叶片PS Ⅱ单位反应中心耗散的能量。

2.4 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟叶片PSⅡ反应中心吸收光能分配参数的影响

由 表2 可见，与CK 相比，pH 5.5 和pH 4.5 模拟酸雨湿沉降处理组烤烟叶片ΦPSⅡ有所增加，而ΦNPQ分 别 增 加8.49%和6.42%，ΦNF分 别 降 低64.71%和52.94%；pH 3.5 和pH 2.5 处理组烤烟叶片ΦPSⅡ分别降低25.47%和27.33%，与对照间差异达到显著水平。说明pH≤3.5 的模拟酸雨湿沉降使更多的PSⅡ反应中心失活，PSⅡ的实际光化学效率降低。而酸雨胁迫下施用外源氯化钙后，烤烟叶片ΦPSⅡ和Φf，D显著增加，PSⅡ的实际光化学效率提高。

表2 酸雨胁迫下氯化钙对烤烟叶片PSⅡ光化学反应吸收光能分配参数的影响①Tab.2 Effects of exogenous CaCl2 on photochemical parameters of PSⅡsystem in flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

3 讨论

本试验中发现，pH≤4.5 模拟酸雨湿沉降处理的烤烟幼苗叶片Fo和Fm显著降低，说明此时伸展叶片的PSⅡ反应中心在完全开放和完全关闭状态时的叶绿素荧光产量均降低［27］。在施加外源氯化钙后，PSⅡ反应中心的开放程度提高以保障类囊体膜上光合电子的正常传递，从而产生同化力用于碳的同化，这可能与Ca 可维持类囊体膜的稳定性有关。光合系统性能指数PIABS既可以反映原初光化学量子产额，也可反映出反应中心的密度和电子在PSI 和PSⅡ间的传递情况，以及光系统的活性，敏感性大于最大光化学效率Fv/Fm［28-29］。因此，将PIABS作为烟草对酸雨反应的有效荧光参数指标。本试验中，pH≤4.5 模拟酸雨湿沉降处理叶片的PIABS显著降低，进一步说明酸雨胁迫下诱导烤烟叶片电子传递受阻主要与PSⅡ受体侧的功能被破坏有关。在酸雨胁迫下施加氯化钙溶液后，处理组PIABS均显著增加，说明施加外源氯化钙提高了烤烟幼苗叶片PSⅡ的电子传递速率。酸雨湿沉降处理后烤烟幼苗反应中心的数量减少，迫使有活性的光化学反应的功能增加，这是植物在逆境条件下自我保护机制作用的结果。叶片施加氯化钙后，PSⅡ剩余活性中心的效率提高。

植物光能的利用情况可用实际光化学效率（ΦPSⅡ）和非光化学淬灭系数（NPQ）来表示［30-31］。但高等植物体中NPQ 的增加是由于类囊体膜两侧质子梯度的建立和叶黄素的循环过程决定的［32］，NPQ 不能代表所有非光化学反应的淬灭过程。除光化学反应外，光呼吸、水-水循环和叶黄素循环等生理过程也会利用植物叶片吸收的光能［33-34］。因此，本试验中将植物叶片叶绿素的激发能分为叶片PSⅡ光化学反应集聚的能量用于光化学反应的量子产额（ΦPSⅡ）、基本的荧光量子产额和热耗散的量子产额（Φf，D）、PSⅡ光化学反应失活的热耗散量子产额（ΦNF）以及类囊体膜两侧质子梯度和叶黄素循环介导的量子产额（ΦNPQ）4 个部分。本研究中发现，pH≥4.5 模拟酸雨的湿沉降处理烤烟叶片ΦPSⅡ、ΦNPQ以及Φf，D均明显增加，说明轻度酸雨（pH≥4.5）处理有助于烤烟幼苗叶绿体中光诱导的质子吸收在类囊体两侧H+浓度梯度的建立，即类囊体膜两侧存在△pH，促进了叶绿体中ATP 合成，进而增强了叶黄素循环介导的光保护机能［35］。与此同时，利用热能的形式耗散掉过剩的光能，避免了光合电子传递链受到过量激发能量的损坏，可减少过量激发能对PSⅡ反应中心的伤害。ΦNF所占比例呈下降趋势，表明轻度模拟酸雨湿沉降处理后PSⅡ反应中心失活的比例下降。pH≤3.5 模拟酸雨湿沉降处理的烤烟幼苗叶片ΦPSⅡ和Φf，D所占比例下降，ΦNF所占比例显著增加，说明重度酸雨阻碍了叶绿体中ATP 的合成，抑制了叶黄素循环介导的光保护机能的发挥，PSⅡ反应中心失活的比例大幅增加。叶片施加外源氯化钙后，ΦPSⅡ和Φf，D增加，烤烟叶片用于光化学反应的量子产额以及PSⅡ的实际光化学效率提高，进而提高了烟草的光合效率。其原因：一是由于Ca2+能与类囊体膜中的磷脂分子结合，所形成的钙盐能维持膜的结构与功能，以此增强细胞膜结构的稳定性［36］；二是Ca2+还能与天线色素CP29 蛋白结合，改变CP29 蛋白的构象，并维持天线色素复合体的功能，避免蛋白复合体的脱离和解体［37］，从而保持光化学反应的顺利进行。

4 结论

采用人工气候箱培养烟苗，在酸雨棚中人工模拟酸雨胁迫条件下，pH 5.5 的轻度酸雨没有影响叶片的表观特征以及PSⅡ的结构和功能，并且在某种程度上有利于幼苗的生长；pH 4.5 的中度酸雨对叶片产生轻微的伤害，但光保护机制和PSⅡ反应中心活性没有被破坏；pH≤3.5 的重度酸雨使叶片枯黄、出现失绿斑点，叶片吸收光能能力下降，PSⅡ受体侧的功能被破坏，电子传递受到抑制，叶绿体中ATP 合成的动力降低，进而影响了PSⅡ反应中心的活性。而在酸雨胁迫条件下，叶面喷施10 mmol·L-1CaCl2溶液可增强光保护机能和提高光化学效率。