表达鼠疫菌F1抗原的重组芽孢的制备及口服免疫效果观察

郭 彦,陈月红,何 雷,李 沛,李江凡,孙世惠,赵光宇,周育森

鼠疫是一种由鼠疫耶尔森氏菌(简称鼠疫菌)引起的人兽共患烈性传染病,能在人群中进行传播,其传染性强,死亡率高,也是制造生物恐怖的重要传染病原之一。疫苗接种是防护疾病侵袭的有效方法[1-2],目前的鼠疫疫苗主要有灭活全菌苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗等,但这些疫苗接种程序复杂,并要求冷藏运输,同时添加了佐剂,不利于进行长时间保存。因此,研究者一直致力于寻求一种能接种简易、耐热稳定、使用安全的疫苗研究新途径。

枯草芽孢杆菌是一种益生菌,在高温、酸碱等恶劣条件时能转化成芽孢形态以抵抗不利环境。因此选择合适的疫苗抗原并利用枯草杆菌芽孢发展为芽孢呈递型疫苗,对疫苗生产条件要求低、易于大规模生产运输、可以口服免疫、使用安全等优势,可作为一种发展新型疫苗的重要方式。F1抗原是鼠疫菌的荚膜抗原,也是其主要的毒力因子之一,能够介导鼠疫菌抵抗宿主吞噬细胞吞噬及抗补体的作用。F1抗体能够通过结合F1蛋白,从而阻断F1蛋白的抗吞噬作用,使机体针对鼠疫的攻击能产生免疫保护作用。

因此,本研究针对鼠疫菌F1抗原,构建和制备了表面展示F1抗原蛋白的重组枯草杆菌芽孢,采用无佐剂直接口服方式,评价重组芽孢对机体的免疫应答。

1 材料与方法

1.1 材料 pDG1664质粒,枯草芽孢杆菌PY-79株,鼠疫疫苗株EV76为本室保存。HRP标记山羊抗小鼠IgG购自Santa Cruze公司。鼠抗F1抗原多克隆抗体由本实验室制备并保存。芽孢染色试剂A/B购自Sigma公司。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。BALB/c雌性小鼠,5～6周龄购自军事医学科学院实验动物中心。

1.2 重组质粒pDG1664-CotB质粒的构建 按照TaKaRA基因组提取试剂盒说明书提取PY-79野生株基因组作为扩增CotB片段的模板。根据序列设计并合成 PCR 引物(5′-3′)CotB-F:GAGATCTACGGATTAGGCCGTTTGTC,CotB-R:TGGATCCGGATGATTGATTGATCATCTGAAG。将扩增的CotB片段与经同样酶切的载体pDG1664质粒连接,转化DH5α感受态细胞,经PCR、酶切鉴定,获得重组质粒pDG1664-CotB,并送北京天一辉远有限公司测序鉴定。

1.3 目的基因F1片段的扩增及纯化 LB培养基过夜培养鼠疫疫苗株EV76,然后提取基因组作为扩增F1抗原片段的模板。根据序列设计并合成PCR引物(5′-3′)F1-F:CGG ATC CAA AAA AAT CAG TTC CGT T,F1-R:AGA ATT CTC ATT ATT GGT TAG ATA CGG TTA C;将扩增的F1片段PCR产物用BamHI、EcoRI双酶切,并回收目的片段,与经同样酶切的pDG1664-CotB连接,构建重组质粒pDG1664-CotB-F1。

1.4 重组枯草杆菌RCotB-F1的构建PstⅠ酶切线性化重组质粒pDG1664-CotB-F1,将已经制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞静置于冰浴融化,加入纯化的DNA线性化产物,充分混匀后冰浴30 min,再转入0.2 cm无菌电击杯中,电转电压为2 500 V,电转时间为5 ms,次数1次。电击完成后立刻加入800μL RM培养基,放置于37℃摇床中200 r/min振摇复苏约3 h,涂于含有红霉素抗性的LB平板,37℃孵箱倒置培养过夜。挑选克隆提取重组菌株基因组,同时以PY-79作为对照。以基因组为模板,用同源臂引物(5′-3′)thr C-F:GAAGGGAACGGTTGGAGC,thrC-R:CGGGAACAGTGACAGAGAAC扩增鉴定。将阳性克隆命名为RCotB-F1。

1.5 重组枯草杆菌芽孢的制备及形态学鉴定 将鉴定正确的重组菌株RCotB-F1单克隆在LB培养基中过夜培养,再以1∶400转接入DSM培养基,继续37℃,200 r/min培养72 h。取各时间段菌液,采用经典的Scharffer-Fulton法对枯草芽孢杆菌染色。

1.6 重组芽孢16S rRNA基因序列测定 提取过夜培养的PY-79与RCotB-F1菌液的基因组。再利用TaKaRA 16S rDNA Bacterial Identification Kit说明书的反应条件及反应体系进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,并切胶回收,将PCR产物送至北京天一辉远生物科技有限公司测序。利用同源序列分析软件MAGE5中将所获结果进行比较。用生物软件构建系统发育进化树。

1.7 SDS-PAGE及 Western blot鉴定重组菌株表面表达蛋白 收集经60 h培养后的重组芽孢,用终浓度为4 mg/mL的溶菌酶37℃处理15 min,再8 000 r/min离心10 min,弃上清;用1 mL ST buffer重悬菌体,将沉淀均匀混合后静置于70℃水浴30 min,再8 000 r/min离心10 min。上清即为芽孢的衣壳蛋白溶液。吸取上清进行Western Blot鉴定。

1.8 免疫荧光及流式方法鉴定重组菌 收集培养好的重组菌株RCotB-F1及PY-79的芽孢,用PBS洗2次,与本室保存的鼠抗F1抗原多克隆抗体室温孵育1 h,再8 000 r/min离心1 min,弃上清,用PBST洗芽孢3次,再用PBS重悬芽孢,加入FITC标记山羊抗小鼠IgG,室温避光反应1 h,再离心收集芽孢,用PBST清洗3次后涂玻片,利用荧光显微镜观察芽孢表面的荧光情况,并同时用流式细胞仪检测芽孢的荧光强度。

1.9 ELISA检测血清抗体水平 将BALB/c小鼠随机分为2组,分别为实验组RCotB-F1和阴性对照组PY-79。按前面步骤离心收集芽孢并纯化、计数芽孢。每次免疫1.5×1010个芽孢,采取灌胃方式,先连续免疫3 d,待首次免疫24 d、25 d及26 d后再连续免疫3 d,之后于距首次免疫第49,50,51 d连续免疫3 d。分别在免疫前及首次免疫后23 d,48 d,68 d,尾静脉采血并分离血清备用。用纯化的鼠疫F1抗原蛋白4℃过夜包被96孔ELISA板,利用ELISA方法检测特异性抗体水平。

2 结 果

2.1 重组菌株RCotB-F1的构建 以枯草杆菌PY-79基因组DNA为模板,利用引物CotB-F、CotB-R通过PCR扩增的CotB基因,同时以EV76菌的基因组为模板,扩增目的基因片段F1;构建重组质粒pDG1664-CotB-F1,具体构建示意图见图1。经测序证实序列正确的重组质粒pDG1664-CotB-F1经PstI酶切,通过电转的方法转入PY-79感受态,利用红霉素抗性筛选出的重组菌株,提取基因组DNA作为模板,以thr C-F/thr C-R为引物进行PCR鉴定。结果表明,PCR扩增出与预期大小相符的条带(图2)。将重组菌株命名为RCotB-F1。

2.2 重组枯草杆菌芽孢的制备及形态学鉴定 将重组株RCotB-F1在DSM培养基中37℃200 r/min振摇培养。根据本研究室前期研究结果,分别在0 h、24 h、48 h和60 h各时间段取菌液,按照经典的Scharffer-Fulton法染色,杆菌染成红色,成熟芽孢染成绿色。结果显示:重组芽孢在60 h时基本全部形成芽孢,形态特征与野生株基本一致(图3)。

2.3 重组芽孢16S rRNA基因序列测定 提取重组菌RCotB-F1及PY-79的基因组,扩增16S rRNA的全长基因,将PCR回收产物送公司测序,得到部分16S rRNA基因序列,用MAGE5同源序列比较及聚类分析,结果表明,按照细菌系统发育进化树进行分类,重组菌株及野生型PY-79菌株都可以归属枯草芽孢杆菌属(见图4)。研究结果证实目的基因F1抗原是通过基因重组的方式整合到枯草杆菌基因组上。

图1 重组质粒pDG1664-CotB-F1构建示意图Fig.1 Constructing sketch map of recombinant plasmid pDG1664-CotB-F1

图2 重组菌RcotB-F1的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of RCotB-F1

2.4 Western Blot鉴定重组菌株表面表达蛋白收集并纯化重组枯草杆菌芽孢RCotB-F1,用F1抗原特异性多克隆抗体对其进行Western Blot鉴定,以PY-79芽孢蛋白为对照,结果显示重组芽孢RCotB-F1在预期条带处有阳性条带,而PY-79无条带(图5)。表明重组芽孢成功表达鼠疫F1抗原蛋白。

2.5 免疫荧光及流式方法鉴定重组枯草杆菌芽孢将重组菌RCotB-F1及PY-79芽孢分别与F1抗原特异性多克隆抗体在室温下反应1 h,PBST洗后加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG再孵育1 h,PBST洗3次涂玻片,离心重悬后涂于载玻片上,用在荧光显微镜进行观察。结果显示,重组菌在显微镜视野可见绿色荧光,而对照组PY-79野生株在荧光显微镜视野中不可见绿色荧光(图6A),同时对经免疫荧光标记的芽孢进行流式检测,结果显示重组芽孢将外源蛋白F1抗原表达于芽孢表面(图6B)。

图3 各时间段枯草杆菌芽胞染色观察结果Fig.3 Staining shape of Bacillus subtilis with electron microscopy

图4 16S rRNA基因序列分析Fig.4 Analysis of Phylogenetie tree based on16S rRNA sequence

2.6 ELISA检测血清抗体水平 将纯化的重组芽孢RcotB-F1及PY-79分别以灌胃的方式免疫BALB/c小鼠,按时间点采集血清并利用ELISA检测免疫小鼠中产生的抗体IgG滴度。结果显示,与PY-79对照组相比,重组芽孢能诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体IgG,具有良好的免疫原性,见图7。

图5 重组菌RcotB-F1的Western Blot鉴定Fig.5 Western Blo test of RcotB-F1 protei

图6A 荧光免疫检测结果Fig.6A Immunofluorescence microscope(×200)

图6B 流式检测荧光结果Fig.6B Flow Results of fluorescence

图7 免疫小鼠血清特异性IgG抗体滴度Fig.7 Detection of IgG antibody titer after immunization

3 讨 论

目前疫苗的形式主要分为灭活疫苗、减毒活疫苗以及重组亚单位疫苗等,这些形式的疫苗均要求低温冷藏运输及保存,使用成本较高,并且由于添加了佐剂不适合长期储备。因此,探索接种简单方便、耐热稳定、常温储存、使用安全的疫苗是目前疫苗研究的新热点。

枯草芽孢杆菌的形态在不同培养条件下可在杆菌及芽孢之间转换,其芽孢可抵抗高温、酸碱等多种不利环境。已有文献证实利用枯草杆菌芽孢免疫机体,可刺激机体局部及全身性的免疫应答,诱导机体产生良好的免疫反应[3-4]。此外,枯草杆菌芽孢本身具有佐剂活性,无需再添加佐剂成分即可口服免疫。2001年Isticato等[5]首次利用芽孢表面展示破伤风毒素片段融合蛋白,直接将重组芽孢口服免疫小鼠,结果显示可诱导小鼠体内产生特异性抗体,说明枯草杆菌芽孢可作为新型疫苗载体诱导机体产生免疫应答。此后有文献报道,将表达破伤风毒素C片段的重组枯草杆菌芽孢冻干,然后长时间保存在常温条件下,用该疫苗免疫小鼠,仍可使小鼠机体抵抗致死剂量破伤毒素的攻击[6]。Ducle H等人[2]用重组CotC-TIFC芽孢注射免疫小鼠,证实重组CotCTIFC芽孢同时诱导产生高滴度的IgG1、IgG2a抗体。国内也有关于基于芽孢CotC防御人华支睾吸虫病疫苗的研究报道[7-8]。本研究室前期研究结果也显示,针对流感病毒M2e保守性抗原建立的枯草杆菌芽孢免疫小鼠不仅诱导产生了有效的体液免疫反应和细胞免疫反应,也产生了粘膜免疫反应;并能使免疫小鼠对病毒的感染产生完全的保护作用[9]。近年来,随着研究的进一步深入,以枯草杆菌芽孢载体为基础的呈递型疫苗已经成为研究的热点。

枯草杆菌芽孢由芽孢衣、内核、皮层及外壁组成,外层的芽孢衣是双层的包膜结构,外层蛋白主要有CotB、CotC、CotG和CotF[10]。研究证实这些衣蛋白(如CotB、CotC)的缺乏不会引起芽孢性状明显的改变,不影响芽孢的形成与出芽[11]。其中CotB基因编码一个46kD的多肽,CotC是一个分子量仅有8.8kD的小分子量蛋白,而CotG的蛋白由9个富含编码Lys、Ser、Arg串联重复序列组成[12]。考虑到蛋白结构稳定性和基因简短性,CotB常作为锚定蛋白,将目的抗原展示在枯草杆菌芽孢表面[13]。枯草杆菌芽孢表面呈递技术是将外源抗原基因与芽孢的锚定蛋白通过基因重组的方式融合表达,使融合蛋白展示在芽孢的表面。重组芽孢可通过口服进入体内,诱导机体产生特异性抗体。

鼠疫是由鼠疫菌引起的自然疫源性烈性传染病,也是重要的生物恐怖剂及生物战剂,传染性强,致死率高,在一些地区可能发生在动物间及人间存在传播扩大的风险[14]。因此,鼠疫疫苗的研究对疾病的预防起着重要作用[15]。但目前的鼠疫疫苗在保存条件、使用安全性等方面仍然存在一些问题,研究者也一直致力于开发各种新型疫苗[16]。F1抗原是鼠疫菌主要的毒力因子之一,也是目前已经明确的鼠疫保护性抗原[17],含有多个抗原决定簇,具有较强的抗原性,也是鼠疫疫苗研究设计中常用的候选靶抗原之一[18-19],因此F1抗原对鼠疫疫苗的研究有着重要意义。文献报道,利用F1抗原制备的鼠疫疫苗能有刺激机体免疫应答,有效保护小鼠抵抗鼠疫菌的攻击[20-21]。因此,F1抗原常作为鼠疫疫苗研究的免疫靶点。

本研究利用枯草杆菌衣壳蛋白CotB与鼠疫菌F1抗原融合表达构建重组质粒;通过同源臂交换基因重组的方式将外源基因整合到PY-79枯草杆菌的基因组上,制备表面展示F1抗原蛋白的重组枯草杆菌芽孢。16S rRNA鉴定重组枯草芽孢杆菌与野生株PY-79同样归属枯草芽孢杆菌属,免疫荧光的结果显示呈递在芽孢表面的融合蛋白仍具有活性。同时,本研究结果显示将重组芽孢无佐剂口服免疫小鼠能诱导机体产生高滴度的IgG抗体,血清中IgG效价与PY-79对照组相比有显著的升高。

总之,本研究利用枯草杆菌芽孢为载体,探索发展了一种耐热稳定、无佐剂口服免疫的新型疫苗技术,该技术为发展口服鼠疫疫苗的研发奠定了基础。

利益冲突:无

引用本文格式:郭彦,陈月红,何 雷,等.表达鼠疫菌F1抗原的重组芽孢的制备及口服免疫效果观察[J].中国人兽共患病学报,2019,35(9):785-790.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.098