贵州茶树藻斑病病原形态及DNA测序鉴定

(贵州大学，贵阳 550025)

茶藻斑病，又称白藻病，是茶树老叶病害之一。主要为害茶、油茶、山茶，其浸染多在中下部老叶片。贵州省此病害原来在茶园中鲜有发现，但在湿度较大环境中，野油茶的叶片上易出现症状。近年来，随着贵州省茶叶种植规模的迅速扩大以及降雨量的增加，该病害在茶园中频繁出现，并有发病不断严重的趋势。过去对该病害的鉴定主要是通过症状观察，贵州省还没有对该病害进行系统的研究，这将影响对该病害防治策略制定，不利于贵州省茶产业的可持续发展。对此，本研究将采集于贵阳市花溪区和黔南州都匀市的茶树藻斑病的标本进行形态学和DNA测序鉴定。

1 材料与方法

1.1 标本采集

在2017年2月初至2018年9月底，课题组对贵州省黔南州都匀市周边螺蛳壳、团山、斗篷山地区茶园以及贵阳市花溪黔陶乡高坡茶园病害的发生情况进行调查，记录各种病害症状并采集了具典型症状的病害标本。

1.2 病原菌的形态学观察

将病害标本叶片先用无菌水清洗5～10 s，接着用75%的酒精清洗5～10 s，最后放入无菌水中清洗后，在无菌操作台中晾干。用无菌刀片将病斑上的病原物刮下，以乳酚油为浮载剂制成玻片，再用Olympus BX 53显微镜(Japan)观察病原的显微结构特征，详述并组制理想的图版。同时对病原物的孢囊梗和孢子囊进行大小测量并求取平均值。

1.3 DNA的提取、PCR扩增及测序

1.3.1基因组DNA的提取

用BIOMIGA Fungus Genomic DNA Extraction Kit (GD 2416)试剂盒进行提取。

1.3.2PCR扩增

采用18 S通用引物(18 S-F/18 S-R)进行PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。

1.3.3DNA测序

对于琼脂糖凝胶电泳检测有杂带的PCR扩增样品，经胶回收试剂盒纯化后，选取pEASY-T 3 Cloning Vector进行目的片段的克隆和转化后，由上海生工生物工程技术服务有限公司根据载体上的通用引物进行测序(M 13 F或M 13 R)。

1.4 DNA序列分析

应用Bioedit软件检测从测序公司获得的序列是否准确，结果若显示双峰或杂峰，则序列准确性不可信，需重新扩增、测序。将峰值整齐的序列上传到NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)进行比对，确定其属级分类地位。参考GenBank中的BLAST功能进行序列比对得到鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

病害症状：老叶上初生黄褐色针头大的圆形小点，以后向四周放射状扩展成圆形或近圆形病斑，大小0.5～1.0 mm，灰绿色至黄褐色，病斑上可见细条状毛毡状物。后期稍会形成隆起，变暗褐色，边缘不整齐，表面平滑，有纤维状纹理，有些时候病斑会形成穿孔 (图1)。

形态特征：病原藻的营养体为叶状体，由对称排列的细胞组成。细胞长行，从中间向四周呈放射状长出，病斑上的毛毡物是病原藻的孢子囊和孢囊梗。孢囊梗呈叉状分枝，长250～500μm，顶端膨大，近圆形，顶端着生8～10个黄色至黄褐色的孢子囊，宽卵圆形，大小为(15～20)μm ×(16～20)μm(图1)。该形态学与报道Pitaloka M.K[2]基本一致。

图1 茶藻斑病症状及病原物寄生性红锈藻形态特征

2.2 DNA测序

采用18 S通用引物(18 S-F/18 S-R)进行PCR扩增后将所获DNA序列在NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里进行序列比对，发现序列与AY 220984[3]的同源性达100%，因此可认定为Cephaleurosvirescens。

3 讨 论

关于茶藻斑病，因为前些年病害为害不重，仅在贵州省个别环境湿度比较大的油茶上观察到。近年来，随着贵州省茶叶种植面积的迅速增大，在部分地区的新老茶园均有发现。贵州省未见该病害的报道，特别是没有该病害DNA序列信息的相关报道，不便于对该病害进行监测及防治，本研究首次结合形态学和DNA测序技术对于茶藻斑病的病原菌进行了鉴定，并明确目前贵州省引起茶藻斑病的病原菌为寄生性锈藻(C.virescens)。