连续离子交换技术高效纯化莽草酸

朱明新 李志强 任长洪

(浙江海正药业股份有限公司，台州 318000)

莽草酸(Shikimic acid, 图1)首次由Eykman于1885年从八角科植物的干燥成熟果实中提取得到[1]。

莽草酸能够通过影响花生四烯酸代谢，起到抑制血小板聚集、动静脉血栓及脑血栓形成的作用[2]。莽草酸还具有消炎、镇痛的功能，是许多抗癌药物的中间体[3-6]。莽草酸还是明星药物“达菲”即磷酸奥司他韦合成的关键中间体[7]。磷酸奥司他韦是目前WHO药物清单推荐用于重症流感患者治疗的唯一可选择药物，长期被公认为是世界上最有效的防治流感的药物之一，成为各国应对可能暴发的大规模流感的储备药品[8-9]。近十年来，随着流感疫情不断在全球蔓延，莽草酸的供应压力持续增大。

图1 莽草酸结构式

目前莽草酸大多从八角提取获得，其产量受气候等自然环境影响较大[10]，再加上提取工艺复杂、纯度难于控制、成本高，莽草酸的产量受到严重限制。

另外，采用微生物发酵法来生产莽草酸的研究日益增多[11-14]。但目前公开的从发酵液中提取莽草酸的工艺[15-16]都存在一个共同的缺点：树脂对莽草酸的吸附量特别低，洗脱液纯度低，不同批次间的收率和纯度波动大等。这导致整个提取工艺生产效率低、成本高，不适合产业化。

本研究采用阴离子交换树脂预纯化步骤，有效去除了莽草酸预处理液中绝大部分强结合力的杂质阴离子，进而显著提高了阴离子交换树脂精纯步骤的处理量、洗脱收率和纯度。巧妙利用了预纯化过程中柱流出液pH和电导率变化与流出液组分变化之间的高度对应关系，将连续离子交换技术运用于预纯化，实现了预纯化过程的连续化、自动化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Agilent公司1260高效液相色谱仪，Dionex公司DX-120离子色谱仪，METTLER TOLEDO公司HA405-DPA-SC-S8在线pH电极，METTLER TOLEDO公司2/4电导率传感器，上海仪电分析仪器有限公司721N可见分光光度计，台州市椒江玻璃仪器厂玻璃层析柱(20 mm X 200 mm)，上海华震科技有限公司HZ201阴离子交换树脂。

莽草酸预处理液由本公司实验室制得，先由本公司保藏的基因工程菌E.coli HZ09-11发酵制得莽草酸发酵液，发酵液再经酸化、陶瓷膜微滤和纳滤浓缩得到莽草酸预处理液。

1.2 分析方法

1.2.1 高效液相色谱(HPLC)检测条件

色谱柱为Grace Smart TM C18(4.6 mm×250 mm，5μm)柱；以0.1% (m/m) H3PO4: 乙腈= 98 : 2 (V:V)为流动相；流速为1 mL/min，检测波长为220 nm，进样浓度为100～800 mg/L,进样量为10 μL。莽草酸含量测定采用外标法，所用对照品采购自sigama公司，含量99.8%。

1.2.2 离子色谱检测条件

色谱柱为IonPac®CS12A(4 mm×250 mm)柱，流动相为3.5 mmol/L Na2CO3和1 mmol/L NaHCO3的混合液，流速为1 mL/min，进样量为25 μL。

1.3 树脂的预处理

阴离子交换树脂采用碱-酸-碱方式再生，最终树脂转为OH-型。碱为1 mol/L的NaOH，洗4BV，酸为1 mol/L的HCL，洗4BV，酸洗碱洗之后均采用去离子水洗至pH为6～8。BV是Bed Volume的缩写，指树脂柱内装载树脂的体积，各种物料量以BV的倍数来表示。

1.4 阴离子交换树脂单柱预纯化

固定好玻璃层析柱(20 mm×200 mm)，湿法装填50 mL已再生的HZ201阴离子交换树脂。以莽草酸预处理液为原料，过饱和上柱，上柱流速为1 BV/h，每0.5～2 BV取柱流出液瞬时样进行检测，包括HPLC、离子色谱、pH、电导率λ、T430 nm。根据瞬时样的各参数变化趋势分析阴离子交换树脂单柱预纯化过程中各组分的分离情况，收集预纯化液。λ高低能够反映料液中处于解离状态的离子浓度高低；预处理液在波长430 nm可见光处具有较大吸收，因此，采用T430 nm来监测预纯化过程中料液色泽的深浅。

1.5 连续离子交换系统进行阴离子交换树脂预纯化

采用的连续离子交换系统是以三根柱为一个单元，每根柱尺寸为20 mm×200 mm，每根装有50 mL的HZ201阴离子交换树脂，柱流出液端配备在线pH电极和在线电导率传感器。系统可根据柱流出液pH、λ的急剧变化自动切换树脂柱进出口阀门，在不同的阴离子交换树脂柱上分别循环进行上柱、收集、顶洗和再生的不间断操作，实现对预纯化过程的精准控制，系统如图2所示。

图2 连续离子交换系统运行模式图

操作过程如下：（1）以莽草酸预处理液为原料，从I柱开始连续上柱，当I柱流出液的pH开始急剧下降时开始收集I柱流出液，至流出液的电导率开始急剧上升时停止收集；（2）随后，将I柱流出液端串联至II柱进口端，I柱采用0.5 mol/L乙酸水溶液顶洗2BV，从II柱流出。I柱顶洗结束后，断开I柱和II柱的连接，I柱开始再生，II柱用莽草酸预处理液开始连续上柱，II柱的上柱、收集、顶洗、再生操作与I柱相同，系统按照I-II-III-I的顺序循环进行阴离子交换树脂柱预纯化；（3）收集的柱流出液即为阴离子交换树脂预纯化液。再生程序即“水-碱-水”方式再生，先水洗至pH＞5，再采用1 mol/L NaOH淋洗4BV，最后水洗至pH＜8待用。

1.6 阴离子交换树脂精纯

以阴离子交换树脂预纯化液为原料，上柱至装有50 mL已再生的HZ201阴离子交换树脂的分离柱，树脂吸附饱和后水洗2BV，再用1 mol/L乙酸水溶液洗脱5BV，洗脱过程中采用HPLC检测洗脱液中莽草酸的色谱纯度，收集色谱纯度≥98%的部分。

2 结果与讨论

2.1 莽草酸预处理液成分分析

实验发现莽草酸预处理液中含有大量结合力强于莽草酸根的杂质阴离子，这些杂质阴离子占据了阴离子交换树脂大部分的交换基团，导致了阴离子交换树脂对莽草酸的有效吸附量非常低，并且也降低了莽草酸与结构类似杂质在阴离子交换树脂上的分离度，导致洗脱液交叉严重。

采用1.4的方法过饱和上柱，柱流出液经离子色谱、HPLC检测，结果如表1所示，柱流出液颜色明显浅于上柱原料。从实验结果可以发现预处理液中强结合力的杂质阴离子及其与阴离子交换树脂结合力强弱顺序如下：强解离的负电色素＞SO42-＞PO43-＞Cl-＞3-脱氢莽草酸根(DHS-)＞莽草酸根(SA-)。其中强解离的负电色素、SO42-、PO43-结合力最强，可看作A组分；Cl-略强于DHS-，DHS-略强于SA-，可将Cl-、DHS-看作B组分。

因此去除莽草酸预处理液中A、B组分成为提高阴离子交换树脂处理量和纯化效果的关键。

2.2 阴离子交换树脂单柱预纯化

采用1.4的方法过饱和上柱，可以利用预处理液中结合力强的组分置换出结合力弱的组分。预纯化去除了预处理液中部分结合力比莽草酸根弱的杂质以及绝大部分结合力比莽草酸根强的A、B组分。以预处理液为原料进行阴离子交换树脂单柱预纯化，原料中莽草酸浓度为7000 μg/mL，色谱纯度88%。所得预纯化液中莽草酸浓度C、pH和电导率λ随上柱液体积V的增加而变化的趋势如图3所示。

图中有两个明显的拐点，14 BV时流出液pH和T430 nm开始急剧下降、λ值有小幅跃升，莽草酸浓度C开始急剧上升至原料浓度以上，说明此时柱内树脂上的OH-已经被置换完全，几乎没有OH-流出，上柱原料中的A、B组分开始将柱内的SA-置换出来；至86BV时，流出液λ值开始急剧上升，pH逐渐下降，C开始逐渐下降，B组分开始略微穿透，说明此时柱内的莽草酸接近被置换完全，结合力比莽草酸略强的B组分(Cl-、DHS-)开始被置换出来，Cl-被置换出来后生成强解离的HCL，所以流出液pH下降、λ急剧上升。A组分仍结合在树脂柱上。收集这两个拐点之间的料液作为阴离子交换树脂预纯化液。

收集的预纯化液几乎不含A组分，仅存在极少量的B组分(Cl-、DHS-)，色谱纯度达到97.4%。预纯化液中莽草酸浓度为10500 μg/mL，提高到了上柱原料浓度的1.5倍，料液颜色明显下降，电导率降低至上柱原料的1/3以下。HZ201阴离子交换树脂预纯化处理量达到1L树脂可处理莽草酸602g。

柱流出液pH、λ曲线的拐点与柱流出液组分变化高度对应，拐点变化趋势明显，因此，可以根据在线pH、λ的变化对预纯化过程实行精准控制。

2.3 利用连续离子交换技术进行阴离子交换树脂预纯化

采用单根阴离子交换树脂柱进行预纯化，在停止收集后，还有少量的莽草酸结合在树脂上，并与B组分交叉在一起。为了提高预纯化收率、并使预纯化树脂处理量达到最大化，更为了实现阴离子交换树脂预纯化过程的连续化和自动化，按照1.5的方法，采用连续离子交换系统进行阴离子交换树脂预纯化。

表1 HZ201阴离子交换树脂过饱和上柱流出液中主要阴离子浓度

图3 HZ201阴离子交换树脂预纯化各参数变化曲线

连续离子交换系统总树脂体积150 mL，上柱原料体积50L，原料中莽草酸浓度7000 μg/mL。收集得到预纯化液27.1L，莽草酸浓度12500 μg/mL，色谱纯度96.7%，莽草酸总质量338.8 g，预纯化收率96.8%。

整个预纯化过程完全实现了连续化、自动化，可以连续不断地上柱并收集阴离子交换树脂预纯化液。系统可根据柱流出液pH、λ的变化对预纯化过程实行精准自动控制，不需要进行HPLC、离子色谱检测，就能保证所得预纯化液的质量稳定均一。预纯化过程不需要使用洗脱剂，顶洗液用量少，因此产生的废水量也很少。

2.4 阴离子交换树脂精纯

阴离子交换树脂预纯化液色谱纯度＞96%，色泽浅，但是料液中还含有较多的糖及其它非色谱杂质，需要进一步精纯。采用1.6的方法对预纯化液进一步精纯，当HZ201树脂接近吸附饱和时，吸附量达到1L树脂吸附莽草酸100 g，与未经过预纯化相比，经过预纯化后，精纯步骤树脂处理量可达到原来的10倍以上。精纯洗脱液色谱纯度达99.4%以上，含量99%以上，3-脱氢莽草酸色谱纯度0.5%以下，洗脱收率95%以上。洗脱液的HPLC图谱如图4所示。

由于精纯洗脱液纯度高、色泽浅，不需要进行脱色、结晶等操作，直接浓缩、喷雾干燥可得到高纯度莽草酸成品。成品的色谱纯度和含量都达到99%以上，提取总收率达到80%以上。

3 结论

图4 预处理液及精纯洗脱液HPLC图谱

本文开发的连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺，解决了发酵法生产莽草酸的提取工艺瓶颈，所得成品纯度高、质量稳定均一，提取收率高；该工艺绿色环保，树脂总使用量减少了约80%，总废水产生量也随之大幅减少；同时该工艺实现了生产的高度自动化和连续化，响应了ICH Q13对连续化生产的大力倡导。采用该工艺能大幅降低发酵法制备莽草酸的生产成本，极具市场竞争力，具有产业化可行性。