探讨无菌检查中和剂β-内酰胺酶IV的作用范围及水解效果

吴扬 文静 王鑫 沈祝飞

(杭州北望生物技术有限公司，杭州 310015)

β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好等优点。根据《中国药典》2015版的要求，β-内酰胺类抗生素可选用β-内酰胺酶去除其抗菌活性，来排除其对供试品无菌检查结果的影响。目前大多厂家用户对β-内酰胺酶的适用范围尚不清楚，存在混淆使用的现象。本研究选取β-内酰胺酶II和β-内酰胺酶IV 对常见β-内酰胺类抗生素分别进行水解实验，为抗生素生产厂家无菌检查选择更具专属性的β-内酰胺酶提供参考依据[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，SW-CJ-1F洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，DNP-9052电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.1.2 菌种

大肠埃希菌[ATCC(B) 25922](浙江省微生物研究所提供)。

1.1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基(批号1564325)、胰酪大豆胨液体培养基(批号1729809)，均来源于OXOID公司。

1.1.4 样品

抗生素药敏纸片均来源于杭州微生物试剂有限公司，各药敏纸片含量见表1。

1.1.5 酶

β-内酰胺酶II(批号：7041725D，杭州北望生物技术有限公司提供，酶活性≥200万单位/支)；β-内酰胺酶IV(批号：6021745D，杭州北望生物技术有限公司提供，酶活性≥200万单位/支)。

1.2 方法

1.2.1 供试液制备

取供试品1支(≥200万单位/支)稀释至每毫升50万单位，贮存备用，贮存温度2～8℃，贮存时间不超过12 h。

1.2.2 菌液制备

接种大肠埃希菌[ATCC(B) 25922]的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24h。

1.2.3 试验组

胰酪大豆胨琼脂培养基经121℃、20 min高压蒸汽灭菌后，冷却至45～50℃；分别添加β-内酰胺酶II和β-内酰胺酶IV至胰酪大豆胨琼脂培养基中，每皿添加活性为50万单位；再取100 μL大肠埃希菌菌悬液(浓度为106cfu/mL)用涂布棒均匀涂布在平皿中，用无菌镊子取药敏纸片平整的贴至平皿上，并做好标记，放置在35℃的恒温培养箱中培养24～48h。

1.2.4 空白对照组

方法同试验组，但是胰酪大豆胨琼脂培养基中不添加β-内酰胺酶，空白组药敏纸片均应有抑菌圈。

1.2.5 判定标准

抑菌圈直径大于20mm以上为极敏感，15～20mm为高敏感，10～14 mm为中敏感，10mm以下为低敏感，0mm为不敏感。

2 结果

培养结束后，量取试验组与空白对照组的抑菌圈3次，根据抑菌圈的大小差异判断供试品是否有中和抗生素活性的能力。头孢类抗生素分解效果对比结果见表2，培南类及其他抗生素分解效果对比结果见表3。

表1 常见的β-内酰胺类抗生素药敏纸片及其含量

3 结论

表2、表3结果表明，β-内酰胺酶II能够分解大多数头孢类抗生素，β-内酰胺酶IV作为一种新型的β-内酰胺酶，既对头孢类抗生素有分解效果，还能分解培南类的抗生素，并且对舒巴坦这类β-内酰胺酶抑制剂有较好的抗性。相比之下，β-内酰胺酶IV的作用谱范围更广泛，作用效果更好。

表2 头孢类抗生素分解效果对比

表3 培南类及其他抗生素分解效果对比