菌种与培养基在抗生素微生物检定法中的应用分析

姚永青，郜继东，刘英

(河南省食品药品检验所，郑州 450018)

抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法，在各国药典中被普遍采用，系利用抗生素在低浓度抑制或杀死微生物的特点，以其抗菌活性为指标，衡量其活性成分效力的方法。虽伴随HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学分析法替代，但由于该方法可以直观、特异的反映抗生素药品的抗菌活性，具有与临床的一致性；多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量与生物活性间的关系；某些抗生素目前尚无适当的化学分析方法表征其活性，因此抗生素微生物检定法在各国药典中仍占有重要的地位[1]。

中国药典2015年版(ChP2015)四部通则收载的抗生素微生物检定法包括管碟法与比浊法，管碟法是抗生素效价测定的经典方法，系利用抗生素在琼脂培养基的平面扩散作用，采用量-反应平行线原理和交叉实验设计方法，在相同条件下通过比较标准品和供试品两者对试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的方法[2]。管碟法试验过程中影响因素较多，如试验菌活性不佳、菌龄过老、市售培养基(包括传代培养基和检定培养基)质量参差不齐等。因此选择合适的菌种和培养基是抗生素微生物效价测定试验的必要条件。

本文以卷曲霉素为例，考察菌种、菌种传代培养基及抗生素检定培养基对抗生素微生物检定法的影响，确定抗生素微生物检定法的系统适用性条件。卷曲霉素是美国礼来公司E.B.Htrr等于1950年从卷曲链霉素的培养基中分离得到的多肽类抗结核抗生素[3]。70年代初，中国科学院北京微生物研究所引进了卷曲链霉菌种，1975年由四川抗生素工业研究所和四川长征制药厂联合研制，1986年由豫南制药厂大批量生产。我国目前剂型为注射用硫酸卷曲霉素，临床主要用于复治、难治及耐药性肺结核[4]，其不良反应主要有听觉减弱、肾功能损害、电解质紊乱、皮肤过敏等。Chp2015版二部、美国药典40版(USP40)、英国药典2000版(BP2000)与国际药典(Ph.Int)第5版均收载原料药与注射剂。

硫酸卷曲霉素法定检验标准为Chp2015二部[5]，含量标定为管碟法-三剂量法，试验菌为枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501，菌种传代培养基为营养琼脂培养基，抗生素浓度范围为10.0～40.0 U/mL，抗生素检定培养基为I号培养基pH7.8～8.0。预试验结果显示中间浓度卷曲霉素溶液(20 U/mL)所致抑菌圈直径相同时，同企业不同批号的检定培养基所需菌悬液浓度明显不同；采用相同的检定培养基时，不同的菌悬液浓度相差较大；采用相同的菌悬液和不同的检定培养基时，中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径相差较大，见表1。

由表1可知，不同品牌培养基传代的菌种和不同品牌抗生素检定培养基对中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径均有一定影响，文献[6]指出试验菌与培养基的质量对抑菌圈边缘的清晰度均有影响，因此选用中检院标准菌株CMCC(B)63501和美国菌种保藏中心标准菌株ATCC6633，分别用两种品牌培养基进行传代备用，选择卷曲霉素标准品配制抗生素微生物效价测定溶液，再分别采用五种品牌检定培养基进行抗生素微生物检定管碟法试验，考察不同来源标准菌株、不同品牌传代培养基与不同品牌检定培养基对管碟法效价测定的影响，为抗生素微生物检定法试验条件的选择与培养基的质量控制提供参考，同时确定管碟法的系统适用性条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

SQ810C立式压力蒸汽灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司)，BD240孵卵箱(德国BINDER公司)，ZY-300IV多功能微生物自动测量仪(北京先驱威锋技术开发公司)，XPE205电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)，T100™ Thermal Cycler PCR 仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。

表1 卷曲霉素效价标定预实验结果

磷酸氢二钾、磷酸二氢钾均为分析纯，水为超纯水。

1.2 标准菌株

选择两种不同来源的枯草芽孢杆菌标准菌株进行试验，见表2。

1.3 培养基

1.3.1 菌种复苏用培养基

胰酪大豆胨液体培养基(批号3106239，C企业)。

1.3.2 菌种传代用培养基

两种培养基成分与pH值均有差异，见表3。

1.3.3 抗生素检定培养基

选择国内5种抗生素检定培养基I号进行试验，见表4。

1.4 样品

卷曲霉素标准品(批号130339-201403，878U/mg，中国食品药品检定研究院)。

2 方法

2.1 抗生素微生物检定法

见Chp2015四部通则1201抗生素微生物检定法-管碟法。

2.2 溶液的制备

精密称取卷曲霉素标准品适量，加水溶解并制成每1 mL中约含1000单位的溶液，加pH7.8磷酸盐缓冲液制成每1 mL中约含16单位、20单位与25单位的溶液，作为供试品溶液。

表2 试验用菌种信息

3 结果

3.1 标准菌株的复苏及菌种鉴定

3.1.1 标准菌株的开启及培养

于超净工作台上分别开启标准菌株I、II，用“1.3.1”培养基复苏，37℃培养22h后分别接种于“1.3.2”培养基a、b的斜面与培养皿上，于37℃培养22h，得斜面与培养皿培养物。分别取培养基a、b的斜面培养物分别接种于培养基a、b茄氏瓶上，于37℃培养7d。

3.1.2 菌种的形态鉴定

标准菌株I、II在“1.3.1”液体培养基表面均有一层菌膜，菌生长状态均良好。

标准菌株I在“1.3.2”培养基a、b斜面、茄氏瓶与培养皿上培养物的形态相同，均为菌落干枯发白，接种棒难以挑取菌落，菌落附着感很强；标准菌株II在“1.3.2”培养基a、b斜面、茄氏瓶与培养皿上培养物的形态相同，均为菌落白色较光滑，接种棒易于挑取菌落，菌落无附着感。

结果显示不同来源标准菌株在相同品牌传代培养基上目视菌落形态差异较大，相同来源标准菌株在不同品牌传代培养基上目视菌落形态一致，表明标准菌株来源影响菌落形态，传代培养基品牌不影响菌落形态。

3.1.3 菌种的仪器鉴定

分别对标准菌株I、II在“1.3.2”项下 a、b培养基培养物进行16s rDNA序列分析，鉴定为枯草芽孢杆菌，鉴定率99%以上，结果表明不同来源标准菌株I、II均为枯草芽孢杆菌。

3.1.4 小结

综上所述，标准菌株I、II均为枯草芽孢杆菌，但其菌落形态不同，传代培养基品牌不影响菌落形态。

表3 菌种传代用培养基

表4 抗生素检定培养基I号(pH7.8～8.0)

3.2 菌悬液制备

取标准菌株I、II的“1.3.2”培养基a、b茄氏瓶培养物各4瓶，分别用灭菌水40mL洗下，制得4种试验用菌悬液，见表5。

3.3 试验结果

分别采用“3.2”项下4种菌悬液和“1.3.3”项下5种检定培养基进行卷曲霉素抗生素微生物效价管碟法试验，所用菌悬液浓度均为0.5%。

3.3.1 采用i号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

采用i号菌悬液和“1.3.3”项下5种不同品牌检定培养基进行试验，双碟菌层形态和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径结果见表6。

由表6可知，i号菌悬液在各企业检定培养基上菌层均浓密。采用B、C与F企业检定培养基产生的抑菌圈均圆整清晰，易于测量；采用D企业检定培养基产生的抑菌圈边缘可见单个菌落，采用E企业检定培养基产生的抑菌圈有轻微双圈现象，均可通过调整抑菌圈测量仪参数进行测量。20 U/mL卷曲霉素溶液在五种检定培养基中所致抑菌圈直径15.4mm～20.8mm，表明菌液浓度相同时，卷曲霉素溶液在各品牌检定培养基上抑菌效力为B企业＞F企业＞E企业＞D企业＞C企业。

3.3.2 采用ii号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

采用ii号菌悬液和“1.3.3”项下5种不同品牌检定培养基进行试验，双碟菌层形态和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径结果见表7。

由表7可知，ii号菌悬液在各企业检定培养基上菌层均有颗粒感，菌层浓密情况不同。采用C企业检定培养基产生的抑菌圈清晰圆整，易于测量；采用D与E企业检定培养基产生的抑菌圈边缘可见单个菌落，可通过调整抑菌圈测量仪参数进行测量；因为菌层稀薄且有颗粒感，所以采用B与F企业检定培养基产生的抑菌圈边缘对测量有影响。20 U/mL卷曲霉素溶液在五种检定培养基中所致抑菌圈直径17.1mm～24.2mm，表明菌液浓度相同时，卷曲霉素溶液在各品牌检定培养基上抑菌效力为B企业＞E企业＞F企业＞D企业＞C企业。

表5 试验用菌悬液

3.3.3 采用iii号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

采用iii号菌悬液和“1.3.3”项下5种不同品牌检定培养基进行试验，双碟菌层形态和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径结果见表8。

由表8可知，iii号菌悬液在B、C、D与E企业检定培养基上菌层均浓密，在F企业检定培养基上菌层较浓密。采用B、C企业检定培养基产生的抑菌圈边缘均圆整清晰，易于测量；采用D企业检定培养基产生的抑菌圈边缘可见单个菌落，采用E企业检定培养基产生的抑菌圈有轻微双圈现象，采用F企业检定培养基产生的抑菌圈较圆整，均可通过调整抑菌圈测量仪参数进行测量。20 U/mL卷曲霉素溶液在五种检定培养基中所致抑菌圈直径16.0mm～22.1mm，表明菌液浓度相同时，卷曲霉素溶液在各品牌检定培养基上抑菌效力为B企业＞F企业＞E企业＞D企业＞C企业。

3.3.4 采用iv号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

采用iv号菌悬液和“1.3.3”项下5种不同品牌检定培养基进行试验，双碟菌层形态和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径结果见表9。

由表9可知，iv号菌悬液在B、C、D与E企业检定培养基上菌层浓密；在F企业检定培养基上菌层稀薄，有颗粒感。采用C企业检定培养基产生的抑菌圈清晰圆整，易于测量；采用B企业检定培养基产生的抑菌圈边缘可见单个菌落，采用D与F企业检定培养基产生的抑菌圈较圆整清晰，采用E企业检定培养基产生的抑菌圈有轻微双圈现象且边缘可见单个菌落，均可通过调整抑菌圈测量仪参数进行测量。20 U/mL卷曲霉素溶液在上述五种检定培养基中所致抑菌圈直径16.4mm～23.8mm，表明菌液浓度相同时，卷曲霉素溶液在各品牌检定培养基上抑菌效力为B企业＞F企业＞E企业＞C企业＞D企业。

表6 i号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

3.3.5 对检定培养基的综合评分

对四种菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果按照菌株生长状态、菌层致密程度、中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径大小与抑菌圈边缘清晰程度进行综合评分，见表10。结果表明B企业的检定培养基质量较差，C企业的检定培养基质量较好。

4 讨论

4.1 卷曲霉素效价测定

4.1.1 试验菌

取不同来源标准菌株用同品牌培养基传代制备菌悬液，采用相同品牌的检定培养基进行效价测定时，结果采用I号标准菌株进行的试验，中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径较小，菌层较致密，抑菌圈较清晰，表明采用I号标准菌株的菌层生长较好。

4.1.2 菌种传代培养基

取相同来源标准菌株，分别采用A与B企业培养基传代后制备菌悬液，采用相同品牌的检定培养基进行效价测定，结果采用A企业传代培养基的菌层比后者浓密，中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径前者小于后者，采用前者的双碟菌层生长状况比后者优良。分析两企业培养基成分，A企业培养基含酵母浸出物，能提供细菌在生命活动过程中需要的生长因子[7]，其他成分基本一致，但其原料中蛋白胨、琼脂与肉浸液的来源和批号不同，导致其内在质量存在差异，因此上述两种培养基所提供营养物质的差异导致菌落性状产生差异，营养丰富的培养基上细菌分裂繁殖速率较快，产生的抑菌圈相对较小，反之，产生的抑菌圈较大。建议根据试验结果选择能提供所需营养物质的最适传代培养基。

4.1.3 检定培养基

取相同来源标准菌株，采用相同品牌培养基传代并制备菌悬液，采用不同品牌的检定培养基进行效价测定，结果采用B企业检定培养基的中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径为20.8mm～24.2mm，不符合三剂量法对抑菌圈直径(15mm～18mm)的要求；采用C、D与E企业检定培养基的试验，中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径均在15mm～18mm；采用i、ii、iii号菌悬液和F企业检定培养基的中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径在15mm～18mm，采用iv号菌悬液和F企业检定培养基的中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径为19.7mm。表明B企业培养基上菌层生长状态相对较差，因此中间浓度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直径相对较大。

表7 ii号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

表8 iii号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

表9 iv号菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验结果

表10 4种菌悬液和5种不同品牌检定培养基的试验综合评分

对试验结果进行综合评分，结果B企业的检定培养基质量较差，C企业的检定培养基质量较好。文中5种检定培养基成分基本一致，但其原料中胨、牛肉浸出粉与琼脂的来源和批号不同，导致其内在质量存在差异，因此需进行预试验以选择最适检定培养基，并建议对培养基的质量进行控制。

4.1.4 小结

采用相同品牌传代培养基和相同品牌检定培养基进行试验，I号标准菌株生长相对较好；采用相同来源标准菌株和同品牌检定培养基进行试验，A企业的传代培养基制备的菌悬液菌层生长较好；采用相同来源标准菌株和同品牌传代培养基进行试验，B企业的检定培养基所致抑菌圈较大，不符合三剂量法抑菌圈直径在15mm～18mm的要求。

4.2 效价测定的系统适用性

抗生素微生物检定法通常需进行预实验以确定最佳的试验条件，如试验菌传代培养基的选择、试验菌的浓度与加菌量、抗生素溶液的浓度、抗生素检定培养基的选择等，使抑菌圈圆整清晰，便于测量，抑菌圈直径大小符合规定，即二剂量法高浓度抗生素溶液所致抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间浓度抗生素溶液所致抑菌圈直径在15～18mm。该试验说明标准菌株、菌种传代用培养基与检定培养基的来源均对效价测定有影响，而菌种在ChP2015通则中有明确规定，因此抗生素微生物效价测定时应选择最适传代培养基与检定培养基作为效价测定的系统适用性条件；目前国内培养基质量参差不齐，应对培养基质量进行严格控制。