微量法筛选黄芪提取液联合左氧氟沙星体外有效抑菌浓度的研究

常凯，江忠勇，曲远青，向礼恩，熊怡淞，王艳艳，邓菊慧，熊杰,*

（1 中国人民解放军西部战区总医院检验科，成都 610083；2 四川省组织修复材料工程技术协同创新中心，南充 637002）

中药黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge, Am]为扶正固本的常用中药，药用黄芪为豆科多年生的膜夹黄芪和蒙古黄芪的干燥根，别名绵芪或绵黄芪[1]。味甘性温，入脾肺二经，有补气升阳、托毒排脓、固表止汗、生肌和利水消肿等功效。黄芪的根中主要成分为黄芪甲苷、黄芪多糖、槲皮素、异鼠李素和氨基酸等。而且富含铜、锌、铁、硒等微量元素[2]。临床常在心血管、免疫、抗癌、抗衰老、血液、肝脏、肾脏等疾病的防治中具有重要作用。近年来研究发现，黄芪不仅具有保护心肌，调节免疫功能，双向调节血糖和抗衰老等作用，同时还具有一定的抗肿瘤与抑菌作用[3]。

左氧氟沙星(levofloxacin, LEV)属于第三代氟喹诺酮类药物，为临床广谱抗菌药中具有重要地位。其作用机制通过抑制细菌DNA解旋酶活性，从而抑制细菌DNA复制与合成[4]。对革兰阳性菌、革兰阴性菌、衣原体和支原体等均有较强且持久的抗菌作用。由于其抗菌活性强于氧氟沙星，且生物利用度高、组织穿透性强，因而被广泛应用于敏感菌所致的呼吸、泌尿系及皮肤组织感染[5]。随着左氧氟沙星在临床中的频次增加，各种不良反应的报道也日益增多。其主要表现形式有胃肠道反应、过敏反应、中枢神经系统不良反应和神经肌肉病变等[6]。

本实验室已有研究表明，低剂量黄芪提取液能通过增加细菌细胞膜通透性，促使增大细胞内左氧氟沙星的有效浓度，从而提高抑菌效果[7]。为了在降低药物副作用风险的同时增强药物活性，故本研究拟初步筛选出常见致病菌抑菌谱及其最佳抑菌浓度，为强效表皮抗感染药物的研发奠定理论基础。

1 材料与方法：

1.1 药品与菌株的制备

左氧氟沙星(每片，0.5g)购于第一三共制药(北京)有限公司。黄芪药材购自中国甘肃省定西市岷县，经西南大学-西藏农牧学院药用植物联合研发中心向礼恩博士鉴定为蒙古黄芪[Astragalus membranaceus(Fish.)Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao]。称取中药黄芪120.00g，加水1000g，煎煮1h，重复1次，合并水煎液，浓缩成含生药1.5g/mL，醇沉，边加边摇匀，低温静置24h；滤过，悬蒸回收乙醇，浓缩至生药2.0g/mL，调节pH值至7.5，煮沸滤过，加入0.125%活性炭，滤过浓缩至含生药2.0g/mL，低温保存，备用[7-8]。

实验菌株为临床常见致病菌标准菌株：大肠埃希菌 (ATCC25922)；金黄色葡萄球菌(ATCC29213)；铜绿假单胞菌(ATCC27853)；化脓性链球菌(ATCC19615)；鲍曼不动杆菌(ATCC19606)；变形杆菌(ATCC33420)；粪肠球菌(ATCC19433)；肺炎克雷伯菌(ATCC700603)；菌株均来源于美国微生物菌株保藏中心，保存于西部战区总医院检验科细胞分子室。

1.2 协同效应评价

分别检测黄芪提取液单独和联合用药时对8种临床常见菌的MIC，以及左氧氟沙星单独和联合用药时对8种临床常见菌的MIC。分别计算8种常见菌各自的FIC指数(FIC=A药联合时的MIC/A药单独时的MIC+B药联合时的MIC/B药单独时的MIC)，FIC指数＜0.5表明具有协同效应，FIC指数=0.5～1表面具有相加效应[9]。

1.3 微量法抑菌浓度筛选

配置M-H液体培养基，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌(M-H培养基加入5%脱纤维羊血)等8种临床常见标准菌株，分装于无菌96孔反应板内，使菌液浓度均为1.0×105CFU/mL。应用倍比稀释方法配置不同浓度配比的黄芪提取液和左氧氟沙星混合液加入对应的反应孔中，终浓度如表1所示，置于37℃培养箱培养18h(化脓性链球菌置于37℃ 5% CO2培养箱培养20h)后，应用酶标仪检测各反应孔OD600吸光度，分析最佳药物配比浓度[10-11]。

2 结果

2.1 黄芪提取液与左氧氟沙星的协同效应

表1 各反应孔药物浓度配比分布(左氧氟沙星+黄芪提取液，μg/mL)

分别检测黄芪提取液单独和联合用药时对8种临床常见菌的MIC，以及左氧氟沙星单独和联合用药时对8种临床常见菌的MIC。分别计算8种常见菌各自的FIC指数(FIC=A药联合时的MIC/A药单独时的MIC+B药联合时的MIC/B药单独时的MIC)。结果如表2所示，在8种临床常见菌中，黄芪提取液联合左氧氟沙星在体外抑菌试验中均表现出明显的协同效应(FIC＜0.5)和相加效应(FIC=0.5～1)。

2.2 黄芪提取液与左氧氟沙星的MIC筛选

应用酶标仪检测OD600的吸光度，结果如图1所示。每个菌种热图中的横纵坐标分别对应表1坐标，即各培养孔药物浓度与表1一致。检测各培养孔在600nm波长处的吸光值，应用软件设置6个吸光值梯度(分别为≤0.08；0.01～0.12；0.12～0.16；0.16～0.20；0.20～0.24；＞0.24)，并生成热图。通过对热图(图1)的结果可以看出同浓度的左氧氟沙星在联合低浓度的黄芪提取液后抑菌效果有明显提升。

表2 黄芪提取液联合左氧氟沙星体外抑菌FIC统计表

结合肉眼判定细菌增长水平，大肠埃希菌在20 μg/mL黄芪提取液+0.5 μg/ml左氧氟沙星的浓度时具有抑制细菌增长的能力；金黄色葡萄球菌在320 μg/mL黄芪提取液+0.0625 μg/mL左氧氟沙星的浓度时具有抑制细菌增长的能力；铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为160 μg/mL黄芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星；化脓性链球菌的最小抑菌浓度为80 μg/mL黄芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星；鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度为80μg/mL黄芪提取液+1 μg/mL左氧氟沙星；变形杆菌的最小抑菌浓度为40 μg/mL黄芪提取液+0.25 μg/mL左氧氟沙星；粪肠球菌的最小抑菌浓度为20μg/mL黄芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星；肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度为40 μg/mL黄芪提取液+0.125μg/mL左氧氟沙星。

2.3 不同菌株的MIC联合分析

图1 黄芪提取液联合左氧氟沙星体外抑菌效力热图

对上述8种菌株的MIC筛选试验结果进行联合分析表明，在160 μg/mL黄芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星时对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌、变形杆菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯菌抑菌效果良好，对大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌效果欠佳(如图2)。

3 讨论

根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)药敏试验标准，微量稀释法能够经济、有效、快速地检测出病原微生物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)[12]。相比于纸片扩散法和琼脂稀释法具有更高的时效性和良好的精密度。为了快速筛选出黄芪提取液联合左氧氟沙星的抑菌浓度范围，本实验选用宽浓度范围的二倍稀释法对8种病原菌的抑菌浓度进行筛选。三次平行试验结果均一，真实可信。

图2 黄芪提取液联合左氧氟沙星体外抑菌有效浓度三维分析图

黄芪的主要成分为黄芪皂苷、黄芪多糖和异黄酮等(如图3)[13]。其中皂苷类物质中含量最高的为黄芪甲苷或称为黄芪皂苷Ⅳ[14]。黄芪多糖则由多种单糖组成，其中葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量丰富。而异黄酮类的毛蕊异黄酮占有较大比例[15]。黄芪在体内和体外研究中均证明其具有一定的抗病毒能力。经证实黄芪甲苷具有抑制乙型肝炎病毒和腺病毒复制的能力并能够诱导细胞凋亡。同时，黄芪对水疱性口炎病毒、流感病毒、sindbis病毒和柯萨奇病毒等也表现出明显的抵抗作用，这可能与黄芪自身能够有效诱导机体产生干扰素的能力有关[16]。然而在临床应用中，黄芪也伴随着不良反应的发生，如由黄芪注射液所产生的不良反应和不良事件较多发生于40～70岁年龄段的人群，主要集中于全身性发热、过敏性休克、恶心、心肌炎和心功能衰竭等。而左氧氟沙星剂量在每日0.2～0.5g时不良反应约占85%。不良反应发生最早出现在用药1min后；用药3d内出现不良反应占总数的74. 86%。而不良反应主要集中在中枢及外周神经系统损害、全身性损害、肌肉骨骼肌系统损害、代谢和营养障碍及神经紊乱等[17-18]。

本研究结果表明，低浓度的左氧氟沙星联合较低浓度的黄芪提取液同样能够具有良好的抑菌功效，同时黄芪自身具有较强的抗病毒和生肌的能力。因而左氧氟沙星联合黄芪提取液有望在降低不良反应的同时达到良好的抑菌目的，为开发新型皮肤抑菌药物提供理论支持。

图3 黄芪提取液中的主要成分