CD151调控肾透明细胞癌细胞迁移侵袭能力的研究

虞亚杰，梁 超，王尚乾，邵鹏飞

(南京医科大学第一附属医院泌尿外科，江苏南京 210029)

四跨膜蛋白家族(tetraspanins)是一种膜蛋白，参与正常的生理过程(比如细胞的活化、增殖、粘附和运动)，同时也参与病理过程(比如肿瘤的进展和转移)[1]。CD151作为四跨膜蛋白家族中的一员，已被证实在乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等肿瘤组织中高表达[2-7]。已有文献报道高表达的CD151和肿瘤的生长、进展、侵袭和转移相关[8-10]。然而，目前关于CD151和肾癌之间关系的研究很少，其在肾癌发生发展中的作用还不明确。本研究拟探讨CD151对肾透明细胞癌的细胞迁移侵袭能力的影响及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料人肾透明细胞癌皮肤转移细胞Caki-1，人肾透明细胞癌细胞Caki-2和人肾腺癌细胞786-0以及人肾小管上皮细胞HK-2(中国科学院生化细胞所)；DMEM、M5A、1640培养基及胎牛血清(Gibco公司，美国)；胰酶(Sigma公司，美国)；磷酸盐缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；SiLent Fect Lipid Reagent 转染试剂(Bio-Rad公司，美国)；siRNA-CD151及对照siRNA(Control siRNA)(苏州吉玛公司)；CD151抗体(Sigma公司，美国)；E-cad、N-cad和Vimentin抗体及山羊抗兔荧光二抗(CST公司，美国)；Transwell小室(Corning公司，美国)；Matrigel基质胶(BD Biosciences公司，美国)。

1.2 细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HK-2细胞，含10%胎牛血清的M5A培养基培养Caki-1和Caki-2细胞，含10%胎牛血清的1640培养基培养786-0细胞。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 细胞转染取对数生长期Caki-1、Caki-2细胞，按每孔1×106个细胞分别接种在6孔板，培养至细胞达到50%融合度时按照转染试剂说明书进行转染，各分为两组，转染CD151特异性siRNA组(siCD151组)和转染非特异性siRNA组(siCtrl组)。培养箱继续培养，24 h内更换新鲜完全培养基。Western blot方法检测转染效率。

1.4 Western blotWestern blot检测肾癌细胞系中CD151蛋白表达水平。提取对数期生长的HK-2、Caki-1、Caki-2和786-0细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存。配置SDS-PAGE胶，每样本取20 μg蛋白常规电泳、转膜。使用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加一抗4 ℃孵育过夜，次日缓冲液漂洗3次，每次5 min，加二抗室温孵育2 h后缓冲液漂洗3次，每次5 min。ECL液显色后曝光拍照，选用β-actin作为内参。

Western blot检测转染效率和CD151基因沉默对E-cad、N-cad和Vimentin蛋白表达的影响。收集转染48 h后的各组细胞，提取总蛋白，以上述同样方法进行实验。

1.5 Transwell迁移侵袭实验迁移实验：胰酶消化已转染过的Caki-1和Caki-2细胞，终止消化离心后用无血清培养基重悬细胞，测浓度，稀释至适宜浓度，在24孔板底部加入600 μL含有20%胎牛血清的培养基，小室内加入200 μL含有2×104个细胞的无血清细胞悬液，将小室小心放入24孔板孔内，避免气泡产生，继续在培养箱中培养24 h。24 h后，用镊子小心取出小室，用棉签轻轻擦去小室内部液体和残留的细胞，室温下用甲醇固定30 min；取出小室，吸干室内液体，移入结晶紫中，室温下染色30 min；取出小室，PBS中漂洗数次，吸干水分，显微镜下随机取5个视野计数，统计结果。

侵袭实验：用50 mg/L Matrigel基质胶稀释液包被灭菌的Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃风干。在24孔板底部加入600μL含有20%胎牛血清的培养基，在小室内加入200 μL含有5×104个细胞的无血清细胞悬液，在培养箱中培养48 h。其他步骤同迁移实验。

2 结 果

2.1 肾癌细胞系中CD151的表达水平Western blot 结果表明CD151在Caki-1、Caki-2和786-0细胞系中的表达高于HK-2细胞系(图1)，说明CD151在肾透明细胞癌中高表达。其中，Caki-1细胞系来源于肾透明细胞癌皮肤转移，而Caki-2来源于肾透明细胞癌细胞、786-0来源于肾腺癌细胞，且Caki-2细胞系中CD151表达稍高，所以最终选择Caki-1和Caki-2细胞系进行后续实验。

图1 肾癌细胞系中CD151表达水平

β-actin：内参；HK-2：人肾小管上皮细胞；Caki-1：人肾透明细胞癌皮肤转移细胞；Caki-2：人肾透明细胞癌细胞；786-0：人肾腺癌细胞。

2.2 Western blot检测细胞转染效率与siCtrl组相比，siCD151组的CD151蛋白表达量明显下降。提示CD151-siRNA可以下调Caki-1和Caki-2细胞中CD151的表达(图2)。荧光转染对照显示转染效率(图3)。

图2 Western blot检测转染后CD151表达水平

2.3 沉默CD151基因对肾透明细胞癌细胞迁移侵袭能力的影响Transwell细胞迁移实验显示，在2种肾透明细胞癌细胞系Caki-1和Caki-2中，与siCtrl组相比，siCD151组穿过Transwell小室的细胞数目分别减少了57%和47%，两组比较差异具有显著性统计学意义(P<0.05)，提示沉默CD151基因后肾透明细胞癌细胞的迁移能力减弱(图3)。

Transwell细胞侵袭实验也得到相似结果，在Caki-1和Caki-2细胞系中，与siCtrl组相比，siCD151组穿过Transwell小室的细胞数目分别减少了32%和43%，两组比较差异具有显著性统计学意义(P<0.05)，提示沉默CD151基因后能抑制肾透明细胞癌细胞的侵袭能力(图4)。

图3 荧光转染对照显示Caki-1和Caki-2细胞转染效率

图4 CD151基因沉默对肾透明细胞癌细胞迁移侵袭能力的影响

A：Caki-1和Caki-2细胞迁移、侵袭；B：Caki-1细胞迁移侵袭分析柱状图；C：Caki-2细胞迁移侵袭分析柱状图。两组比较，*P<0.05(n=3)。

2.4 干扰CD151基因对E-cad、N-cad和Vimentin蛋白表达的影响Western blot实验检测与EMT相关的蛋白变化，结果显示，siCD151组Caki-1和Caki-2细胞中E-cad的蛋白表达水平比siCtrl组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而N-cad和Vimentin的表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。以上结果提示CD151基因可能通过促进上皮间质转化过程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促进肾透明细胞癌细胞的迁移侵袭能力。

图5 转染siCD151后两种肾透明细胞癌细胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白的表达

A：Western blot检测；B：E-cad蛋白表达灰度分析柱状图；C：N-cad蛋白表达灰度分析柱状图；D：Vimentin蛋白表达灰度分析柱状图。两组比较，*P<0.05(n=3)。

3 讨 论

研究发现CD151(也称作GP-27、MER2、PETA-3、SFA-1或者Tspan24)在不同的细胞类型中都有表达[11]，并且已被证实在乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等肿瘤组织中均高表达[2-7]。有文献报道CD151通过介导细胞粘附相关信号通路而调节细胞功能，从而促进骨肉瘤的转移[12]。CD151也可以通过与其他四跨膜蛋白家族成员(比如CD9、CD81)或者整合素(integrins)交互作用从而发挥调节细胞转移和粘附的作用[13-14]。仅有少量文献报道过CD151可能用来预测肾透明细胞癌的进展和转移潜能[15-16]。本研究也证实，CD151在肾透明细胞癌细胞系中高表达，干扰CD151基因的表达后肾透明细胞癌细胞的迁移、侵袭能力明显下降。

肿瘤细胞的转移涉及一系列的细胞生理改变(比如EMT)，以及增加并激活细胞外一些蛋白酶(比如MMPs)从而降解细胞外基质等复杂的过程[17]。EMT，即上皮间质转化，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。其主要的特征有上皮表型(比如E-cad)的丢失和间质表型(比如N-cad和Vimentin)的获得[18]。本研究证实，与对照组相比，干扰组E-cad的表达量显著升高，N-cad和Vimentin的表达量则显著降低。因此，我们推测CD151对肾透明细胞癌细胞的迁移侵袭能力的影响可能是通过促进EMT而实现的。TGF-β1 被公认为通过诱导 EMT 而起到肿瘤启动子的作用，我们推测 CD151 可能影响 TGF-β1的表达，进而激活EMT过程，从而促进肾癌转移。但是，本研究目前还存在一些局限性，比如转录后调控的具体机制尚需进一步研究，还缺乏体内实验来验证 CD151 在肾透明细胞癌发生发展中的作用。下一步，我们将持续关注国际上的相关研究进展，并开展进一步研究，着重探究CD151与TGF-β1/Smad信号通路以及肾透明细胞癌之间的关系。

综上所述，CD151通过促进EMT而增强肾透明细胞癌细胞的迁移与侵袭能力，该基因有可能成为肾透明细胞癌生物治疗的重要靶点。