重金属和酞酸酯复合污染对土壤酶活性的影响

杨宁宁，梁青芳，高 煜，耿雅妮

(宝鸡文理学院/陕西省灾害监测与机理模拟重点实验室，陕西 宝鸡 721013)

近年来，工农业高速发展加剧了污水灌溉及农药化肥的大量使用，使进入生态系统中的各种污染物以复合污染成为土壤环境污染的主体[1]，因此对复合污染现象的研究本质上是治理好土壤环境污染的问题[2-3]。

所有环境污染物源自土壤，它既是多种污染物又是复合污染系统，因此土壤复合污染联合生态毒性效应研究长期以来备受重视[4-5]。现如今主要是以单一或多种重金属的不同影响因素方面，研究其对土壤活性酶的影响[6-8]。另一方面，酞酸酯(PAEs)作为有机化合物，具有可塑性、易脱离塑料进入环境介质中，长期存在土壤中往往能引起儿童性早熟[9-10]。且随着塑料制品农用薄膜大量生产使用，越来越多的DBP与DEHP类酞酸酯化合物进入农田土壤等环境介质中[11-12]，并通过植物吸收进入食物链。

迄今为止，国内外学者对酞酸酯的研究大多仅关注其污染现状，其较多累积于环境和人群中，生物降解速率低[13-15]。为了直观地表示污染毒性效应，土壤污染毒性效应引入土壤酶活性来表征污染物处理对测试指标造成的影响。目前，很多学者用土壤酶活性指标来表征土壤重金属符合污染的研究状况[16-20]。有机物与重金属复合污染是一类主要的污染类型。而有关重金属与无机、有机复合污染研究以及关于酞酸酯的其他生态效应和环境行为，如对土壤微生物的毒性效应的报道很少。

迄今，用土壤酶活性表征酞酸酯与重金属组合的复合污染研究较少。本研究以土壤环境中的2类典型污染物——重金属(Cd、Zn、Pb)和酞酸酯(DMP、DnBP、DEHP)为研究对象，采用均匀设计法，初步探讨了复合污染对脲酶和过氧化氢酶活性的影响，以期为土壤复合污染的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

室内试验于2017年2～3月在陕西省灾害监测与机理模拟重点实验室中进行。

1.2 供试土壤

选取宝鸡文理学院校园土为供试土壤，取0～20 cm的表层土，混合均匀后带回实验室。在实验室内展开、风干，挑拣土壤中的植物、残根、石块及其他杂物，用木碾研磨过3 mm筛。处理后的土样装入密封袋中封存、备用。土壤样品的主要理化性质：pH值8.3、有机质18.34 g/kg、总氮1.61 g/kg、总磷2.31 g/kg、阳离子交换量15.91 cmol/kg。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 本试验设计11个处理，每个处理重复3次，共33个，因子水平详见表1。将配制好的土壤取样1次，随后Cu、Zn、Pb分别以CuSO4·5H2O、Zn(CH3COO)2·3H2O、Pb(CH3COO)2·3H2O溶液形式，DMP、DnBP、DEHP以有机物按照均匀设计表的设计加入并充分搅匀(表2)。

表1 试验因子和水平 mg/kg

表2 均匀设计表

试验期间土样在培养皿中培育，并随意摆放在生化培养箱，每周将土样位置随机移动1次，尽量使每个土样微环境保持一致，室内温度因开窗对流基本与环境温度保持一致，每天用15 mL去离子水浇灌，保持所有供试土壤田间持水量在60%左右。分别于1、3、5周后对土壤取样各1次，每次取样时从对照组各取1/2样品。

以过氧化氢酶、脲酶的活性为土壤毒理指标，Cd、Zn、Pb、DnBP、DEP、DBP的含量和培养时间作为影响土壤酶活性的因素。6种外源污染物复合作用对2种土壤酶活性的影响选用6因素10水平的U10(106)型均匀表，重金属指标水平参照土壤环境质量标准(GB 15618─1995)[21]，塑化剂指标含量参考美国纽约土壤PAEs控制和治理标准[22]。

1.3.2 脲酶和过氧化氢酶活性的测定方法 土壤脲酶的测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法进行测定。以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。主要是在显色反应后，1 h内在紫外分光光度计于波长578 nm处进行比色测定，见公式(1)。

A=(Ms-Mo-Mw)×100×10

(1)

式中：A指土壤脲酶活性；Ms指土样的光密度值在标线上对应的氮毫克数；Mo指无土对照的光密度值在标线上对应的氮毫克数；Mw指无基质对照的光密度值在标线上对应的氮毫克数；100是样品定容的体积与测定时吸取量的比值；10是脲酶活性单位的土重与样品的比值。

过氧化氢酶能将H2O2分解为O2和H2O，通过测定H2O2的减少量来测定过氧化氢酶活性。过氧化氢在波长240 nm处有强烈的吸收力，通过测定与土壤反应后，根据溶液此时的吸光度，就可以算出溶液中过氧化氢的溶度，从而可以计算酶的活性，见公式(2)。

(2)

式中：A是过氧化氢酶的活性；W是土样重量；51是转化为过氧化氢的毫克数(20 min)；Lo是无土溶液的吸光度；Lx是土样溶液的吸光度；Lw是无基质溶液的吸光度。

1.3.3 模型建立 采用多元线性回归分析方法(采用R软件统计)，方程模型见(3)。

y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x4+b5x5+b6x6

(3)

式中：x为土壤重金属含量；y为土壤酶活性。

1.3.4 统计分析 试验数据采用Microsoft Excel 2010处理，重复3次平均值±标准差，采用R数据分析软件进行相关分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 脲酶和过氧化氢酶抑制效果比较

图1对比了整个培养期间(35 d)重金属和酞酸酯复合污染对脲酶和过氧化氢酶的抑制效果。酶的活性选用对照百分比λ表示(对照的活性为100)。由图1可知，随着培养时间的延长，样品中土壤酶的活性受到不同程度的抑制。其中脲酶比过氧化氢酶更加敏感，对于脲酶来说，7 d后酶活性均高于200%，21 d时为3%～180%，35 d时为6%～132%。最大抑制率为培养21 d的样品S3、S4和S5，均达到90%以上，可见，脲酶可以作为土壤重金属和酞酸酯复合污染程度的一个指标。而对于过氧化氢酶，处理后7 d过氧化氢酶活性均被抑制，最大抑制率为7 d的样品10，酶活性降到了对照的4.33%，21 d时酶活性为52.37%～127.94%，35 d过氧化氢酶的抑制程度处于16.13%～105.17%之间，在35 d后过氧化氢酶除了土样中的S4、S5、S7外，其他的都呈现出明显的激活作用，激活范围在76.27%(S9)～106.27%(S8)之间，这种现象出现的原因可能是土样中的污染物被土壤降解和吸附以及微生物的忍耐性增强了，已经适应了这6种污染物，改变了污染物的可利用性。

从图1可以看出，具有同种污染物组成而浓度不同的样品S1、S3、S4、S5、S8、S9中，重金属和酞酸酯复合污染对脲酶和过氧化氢酶的抑制作用差异极大，抑制范围为9%～99%。可见，随时间影响，重金属和酞酸酯复合污染与污染物的密度密切相关。

图1 不同土壤样品在不同培养时段的土壤酶活性

2.2 重金属和酞酸酯的复合作用对土壤酶活性的影响

Cd、Zn、Pb和DMP、DnBP、DEHP复合污染对上述2种酶活性的影响差异较大。从这6种因子的多元线性回归分析中可见(表3)，影响土壤脲酶活性的主要因子依次为：Cd>DnBP×DMP>Pb×DMP>DMP×Zn>DnBP>Zn。影响过氧化氢酶活性的主要因子依次为：Cd>Pb>DMP×Zn>DnBP×Pb>DMP>Zn。其中，Cd对脲酶活性具有显著的拮抗作用。Pb对过氧化氢酶活性也具有显著的拮抗作用。Zn、DMP×Zn对脲酶表现出协同作用，除此之外均表现出拮抗作用。DnBP×Pb、DMP、Cd对过氧化氢酶活性均表现出协同作用，其他因素对过氧化氢酶则表现为拮抗作用。

表3 六因子含量与土壤酶活性的多元回归分析结果

3 讨论

重金属与有机物复合污染土壤酶活性的影响较多，如谷盼妮等[4]发现环草隆中加入镉会改变其微生物毒性效应，且镉浓度不同影响也不同。王果[23]研究发现，铜离子能降低草甘磷在矿物上的吸附性能，从而增加草甘膦的生物有效性。Wang等[24]研究丁草胺与镉对土壤脲酶及磷酸酶活性的影响与两者浓度配比有很大关系。以上研究与本研究中酞酸酯和重金属对土壤酶的刺激作用可能是微生物对污染物的适应所致，不同重金属和酞酸酯复合作用类型不同的结果类似。同时，本研究还发现复合添加6种污染物使脲酶和过氧化氢酶有了不同程度的抑制效果，随着时间的推移，出现了抑制率降低，甚至有激活的现象。这可能是由于污染物被微生物分解或者被土壤的空隙吸附而失去其有效的抑制效果，使得土壤酶出现了一定的抗性。

此外，重金属与有机物的毒性效应对土壤行为有影响作用。如沈国清等[16]研究表明，菲和镉复合污染毒性效应的持续时间比单一污染更长。谷盼妮等[4]发现，重金属Zn与菲复合作用下土壤脲酶表现出协同作用，而重金属Cd和Zn对脱氢酶具有拮抗作用。与本研究中不同重金属和酞酸酯复合作用类型不同的结果类似，Cd对脲酶活性具有显著的拮抗作用，Pb对过氧化氢酶活性也具有显著的拮抗作用，有力地说明了土壤酶活性变化可能与酞酸酯和重金属复合刺激下，微生物对污染物的适应所致有关。

4 结论

(1)重金属和酞酸酯复合对土壤酶活性的影响表现为：脲酶活性随着时间增长酶活性先下降后上升，而过氧化氢酶活性则相反，随时间先下降后上升。

(2)影响土壤脲酶活性的主要因子依次为：Cd>DnBP×DMP>Pb×DMP>DMP×Zn>DnBP>Zn。影响过氧化氢酶活性的主要因子依次为：Cd>Pb>DMP×Zn>DnBP×Pb>DMP>Zn。

(3)DnBP×DMP对脲酶表现出拮抗，DMP×Zn对脲酶表现出协同作用。Cd对脲酶一直起着抑制的作用。DnBP×Pb对过氧化氢酶表现出协同作用，而DMP×Zn对过氧化氢酶表现为拮抗作用。