HPLC法测定盐酸二甲双胍片的含量及测量不确定度评定

(石家庄市食品药品检验中心，石家庄 050031)

盐酸二甲双胍属双胍类口服降血糖药物，用于单纯饮食控制不满意的Ⅱ型糖尿病病人，尤其是肥胖和伴高胰岛素血症者[1]。盐酸二甲双胍片现行质量标准收载于《中国药典》2015年版(二部)[2]，相关标准采用紫外-可见分光光度法测定含量。该方法受辅料影响，测定准确度低、精密度差。本实验研究了高效液相色谱法测定盐酸二甲双胍片的含量，该方法准确度高、重现性好，有利于制剂的质量控制与评价。依据国家计量技术规范JJ1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[3]对所用含量测定方法进行不确定度评定，从人员、仪器、方法、环境等方面分析不确定度的来源，并计算各不确定度分量的量值，反映测量结果的准确性和置信度，为实验过程的控制和检测报告的评估提供科学的依据[4,5]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1仪器

LC-20AD型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、Labsolution工作站(日本岛津公司)；XS105型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ2200超声清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。

1.1.2药品与试剂

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠(色谱纯，东京化成工业株式会社)；磷酸氢二钠(分析纯，北京化工厂)；磷酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(取己烷磺酸钠1.88 g，磷酸二氢钠0.78 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH值至3.5±0.05)-乙腈(90∶10, V/V)；检测波长：233 nm；柱温：30 ℃ ；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.2溶液的制备

(1)对照品溶液

精密称取盐酸二甲双胍对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100664-201604，纯度：100%，105 ℃干燥2 h)约25mg，置50mL量瓶，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5.00 mL置50mL量瓶，加水稀释至刻度，即制成每1mL中约含50μg的溶液，作为对照品溶液。

(2)供试品溶液

取样品(盐酸二甲双胍片，生产企业：SJZYL，批号：A1708001，规格：250mg，薄膜衣片)20片，研细，精密称取细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍100 mg)，置100 mL量瓶中，加水适量，超声15 min使盐酸二甲双胍溶解，用水稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液20 mL，精密量取续滤液5 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

(3)空白辅料溶液

精密称取生产企业处方中包含的所有辅料适量，按“1.2.2(2)”项下方法进行操作，制成空白辅料溶液。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1系统适用性试验

精密量取“1.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液与空白辅料溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。由图1可见，在该色谱条件下，待测成分峰与溶剂、辅料及其他杂质峰分离较好；二甲双胍峰保留时间约为5.2 min，理论板数按二甲双胍峰计≥3 000，拖尾因子≤1.5。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.含量测定用供试品；C.空白辅料；1.二甲双胍

2.1.2线性关系考察

取“1.2.2”项下盐酸二甲双胍对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中含盐酸二甲双胍10、20、30、50、70、100μg的系列溶液，精密量取上述溶液各20 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以盐酸二甲双胍质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制回归曲线，得线性回归方程为y=79 881.4x+28 479.5(r= 0.999 9)。结果表明，盐酸二甲双胍检测在质量浓度10～100 μg/mL的范围内呈良好的线性关系。

2.1.3检测限与定量限

取“1.2.2”项下对照品溶液适量，用水逐级稀释，分别按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，按3倍信噪比计算得到检测限，按10倍信噪比计算得到定量限。结果，盐酸二甲双胍的检测限为0.45 μg/mL、定量限为1.5 μg/mL。

2.1.4精密度

精密量取“1.2.2”项下对照品溶液20 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进样，连续测定6次，记录色谱图，二甲双胍峰面积的RSD=0.2%(n=6)。结果表明，仪器精密度良好。

2.1.5稳定性

取“1.2.2”项下含量测定用供试品溶液适量，在室温条件下放置0、2、4、6、8、12、16、20、24 h时分别精密进样20 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，二甲双胍峰面积的RSD=0.3%(n=9)。结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.1.6重复性

按“1.2.2”项下方法分别制备6份含量测定用供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算含量。盐酸二甲双胍含量的RSD=0.3%(n=6)，结果表明，方法的重复性较好。

2.1.7回收率

按最大处方量取空白辅料9份，分别置于200 mL量瓶中，每3份精密加入相当于样品含量80%、100%、120%的对照品各适量，按“1.2.2”项下方法制备含量测定用供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表1。

方法学验证结果表明，该HPLC法测定盐酸二甲双胍片含量的准确度高、专属性强、线性范围宽、重现性较好。

表1 回收率试验结果(n = 9)

2.2 HPLC法测定结果

精密量取“1.2.2”项下对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按“1.2.1”项下液相色谱条件，记录主峰面积，按外标法以峰面积计算盐酸二甲双胍含量，盐酸二甲双胍片的含量测定结果为98.6%。

2.3 测量不确定度评定

2.3.1 数学模型的建立及测量不确定度的来源分析

依据国家计量技术规范JJ1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[3]，评定上述HPLC法测定盐酸二甲双胍片含量的测量不确定度。根据测定原理，以含量的计算公式作为不确定度评定的数学模型，其计算公式为：

式中：Y——供试品中盐酸二甲双胍的标示百分含量；

AX——供试品溶液主峰面积；

AR——对照品溶液主峰面积；

mx——供试品的称样量(mg)；

mR——对照品的称样量(mg)；

PR——对照品的纯度；

Vx——供试品的稀释体积(mL)；

VR——对照品的稀释体积(mL)；

标示量：250mg/片，即该批次产品的规格。

2.3.2测量不确定度各分量的评定

则对照品的稀释体积引入的相对不确定度为：

(6)供试品溶液稀释体积引入的相对不确定度(urel(Vx))：此分量的不确定度分析同“2.3.2(5)”，供试品溶液配制过程用到100mL单标量瓶2次及5mL单标吸管，则，

(7)对照品溶液主峰面积引入的相对不确定度(urel(AR))：其不确定度主要由峰面积测定重复性引入。分析影响峰面积测定结果的因素包括：液相色谱仪自动进样器取样的体积、输液泵的稳定性、系统压力、待测组分流经色谱柱的保留程度、检测器的稳定性等。但由于对照品溶液与供试品溶液在相同条件下测定，在计算不确定度时上述进样、分离、检测过程的影响，可以合并为峰面积测定的重复性误差[6]。对照品为两个平行样品，分别连续进样测定其峰面积5次和2次，测定结果见表2。

表2 对照品峰面积测定结果

(8)供试品溶液主峰面积引入的相对不确定度(urel(Ax))：此分量的不确定度分析同“2.3.2(7)”， 供试品为两个平行样品，分别连续进样测定其峰面积2次，测定结果见表3。

表3 供试品峰面积测定结果

2.3.3 合成相对标准不确定度及扩展不确定度的计算

测量结果符合正态分布，包含概率为95%时，包含因子k=2，相对扩展不确定度urel=k·uc,rel=2×0.632%=1.3%。

表4 各分量的相对标准不确定度

2.3.4结果报告

本实验中，HPLC法测定盐酸二甲双胍片含量的测量结果表示为：X=(98.6±1.3)%，k=2。

2.4 结果讨论

HPLC法测定盐酸二甲双胍片含量，以甲醇或乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相，二甲双胍峰均在约2min，表明二甲双胍均没有很好的键合保留[10]。在磷酸氢二钠溶液中分别加入适量的戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠与庚烷磺酸钠，再分别用磷酸调节溶液的pH值为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5。结果，以磷酸盐缓冲液(含0.01 mol/L己烷磺酸钠溶液与0.005 mol/L磷酸氢二钠溶液，pH 3.5±0.05)-乙腈(90∶10, V/V)为流动相时，二甲双胍峰的平均理论板数最高，选择该流动相用于HPLC法测定盐酸二甲双胍片含量。

采用不同品牌与规格的C18色谱柱3支：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Inertsil®ODS-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)与Diamonsil Plus 5μm C18-B(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，测定相同供试品溶液，均取得了较好的柱效，表明该方法适用性较好。且前者柱效最优，以前者作为试验用色谱柱。

实验从11个地级市抽取盐酸二甲双胍片样品42批次，采用HPLC法对上述不同生产企业不同批次的样品进行含量测定，所得结果与现行标准中UV法检验的数据进行比较，结果基本一致，表明HPLC法具有较好的实用性。

测量不确定度评定过程中，对各不确定度分量的数值进行评估，最大的测量不确定度来源于对照品的称量。为减小测量结果的不确定度，一方面，需要做好天平的定期检定与维护保养，以保证称量数据的有效可靠；另一方面，在实际操作中选择精度符合要求的天平进行称量，适当增大对照品和供试品的称样量，称量过程操作规范、控制严格[11]。影响不确定度的主要来源还有对照品的纯度，要尽量选择权威机构发布的，具有标准物质证书与纯度量值的对照品。对照品与供试品溶液稀释过程的影响，可通过使用允差小、经校正合格的容量仪器进行稀释[12,13]。此外，应定期做好高效液相色谱仪的计量检定、期间核查与维护保养工作，以确保测定数据的准确可靠，从而提高测定结果的准确度[14,15]。

3 结论

研究了HPLC外标法测定盐酸二甲双胍片的含量，并对含量测定结果进行测量不确定度评定。该方法准确度高、重现性好，有利于提高该制剂的质量控制。同时，可为同品种不同剂型或类似检验方法的测量不确定度评定提供有力的参考。