表达羊口疮病毒B2L 蛋白重组小反刍兽疫病毒的拯救

刘拂晓，孙成友，李 岭，王志亮

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

羊口疮（orf）又称传染性脓疱（contagious ecthyma），由羊口疮病毒（orf virus，ORFV）感染引起[1]。该病最易感染羔山羊和羔绵羊，多呈群发性流行，成年羊对其同样易感，人亦可感染，因此属于人兽共患病。患病羊主要表现为口唇处皮肤和黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡并结成疣状厚痂。该病主要通过密切接触传播，病羊损伤的皮肤及黏膜是主要的传播途径，也可通过被病羊污染的厩舍或牧场传播。本病通常采用弱毒苗免疫接种进行预防：对3 月龄以上羊，采用下唇划痕接种；对3 月龄以下羊，采用后股内侧划痕接种。ORFV 属痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）成员，为两端共价闭合的线性双股DNA 病毒，基因组全长约135 kb[2]。ORFV B2L 基因（开放阅读框为1 137 bp）编码一个高免疫原性的囊膜蛋白（B2L蛋白，379 aa，约42 kD）。该蛋白可在体内诱导较高滴度的病毒中和抗体[3]，具有肿瘤治疗及修饰免疫反应的潜力[4]。

小 反 刍 兽 疫（peste des petits ruminants，PPR）是另一种羊常见传染病，由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）感染引起。该病主要通过密切接触传播，以呼吸道和消化道为主要感染途径，最易感染绵羊和山羊，羔羊更易感染发病，急性感染的死亡率可高达100%[5]。发病羊临床主要表现为精神沉郁、厌食、高温，口腔内膜充血、溃疡、糜烂，坏死组织脱落后形成不规则的糜烂斑，同时眼鼻伴有脓状分泌物[6]。PPRV 或称小反刍动物麻疹病毒（small ruminant morbillivirus，SRMV）[7]，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）成员，可表达6 种结构蛋白（N、P、M、F、H、L 蛋白）和2 种非结构蛋白（V、C 蛋白）[8]。预防PPR 的主要方法是弱毒苗免疫。Nigeria75/1 疫苗株是目前应用最为广泛的PPRV 弱毒疫苗株，可在羊体内诱导至少3 年的免疫保护期。另外，该疫苗株也是良好的病毒载体，通过反向遗传技术拯救（或称“复活”）的重组PPRV，可在体内诱导良好的双重免疫反应[9-10]。

副黏病毒反向遗传技术现已广泛用于改造并拯救重组病毒。通常根据不同需求构建全长cDNA clone，并构建3 个辅助质粒（N、P、L 蛋白真核表达质粒），然后将4 个质粒同时转染细胞以拯救重组病毒。本课题组过去已成功构建了PPRV 反向遗传操作系统，并利用该系统拯救了两株重组PPRV[11-12]。本研究首先构建了含B2L 开放阅读框的重组PPRV cDNA clone，然后利用已构建的反向遗传系统，成功拯救出表达B2L 蛋白的重组PPRV（rPPRV-B2L），从而为两种疫病的二联疫苗研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及质粒

表达T7 RNA 聚合酶的BSR-T7/5 细胞，表达SLAM 受体的Vero-Dog-SLAM（VDS）细胞：本实验室保存；无任何修饰的Nigeria 75/1 PPRV（Genbank 登录号KY628761）拯救毒（rPPRV）：本实验室构建并保存；rSRMV-eGFP cDNA clone、pCAGGS-N、pCAGGS-P 及pCAGGS-L：本 实 验室构建并保存。

1.2 主要试剂

Not I 及Pme I：NEB 公 司 产 品；In-fusion同源重组试剂盒、PrimeScript ™ One Step RTPCR Kit、PrimeSTAR Max Premix、无 蛋 白 封 闭液、HST16CR 感受态细胞：宝生物公司产品；PureLinkTM质粒提取试剂盒、DMEM 培养基、G418、胎牛血清（FBS）、Lipofectine 2000转染试剂、Pierce ECL 化学发光底物：Thermo Scientific 公司产品；High Pure Viral Nucleic Acid Kit：罗氏公司产品；anti-mouse IgG-peroxidase：Sigma 公司产品；B2L 蛋白单抗：黑龙江八一农垦大学于永忠老师惠赠。

1.3 rPPRV-B2L cDNA clone 构建

对本课题组保存的rSRMV-eGFP cDNA clone[11]进行改造，构建含B2L 基因开放阅读框 的 重 组PPRV cDNA clone（rPPRV-B2L cDNA clone）。操作如下：利用Not I/Pme I 双酶切消化cDNA clone，回收载体片段；利用In-fusion 试剂盒，通过同源重组方法，将载体片段与B2L 基因（Genbank 登录号KX951407）开放阅读框（两端添加同源重组臂）进行同源重组；将重组质粒转化HST16CR 感受态细胞，涂布平板，37 ℃过夜培养；挑取典型菌落培养并进行测序验证；对序列正确的rPPRV-B2L cDNA clone，采 用PureLinkTM质 粒 提取试剂盒，提取高纯度的转染级质粒。

1.4 rPPRV-B2L 拯救

将rPPRV-B2L cDNA clone 及3 个 辅 助 质 粒（pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L） 共 转染BSR-T7/5 细胞。操作如下：转染前一天，取一6 孔板接种BSR-T7/5 细胞。次日，细胞汇合度为70%左右时，采用Lipofectine 2000 转染试剂，将4个质粒共转染至BSR-T7/5 细胞。rPPRV-B2L cDNA clone、pCAGGS-N、pCAGGS-P 和pCAGGS-L 转染量分别为2.5、1.5、1.0、1.0 μg/孔。吸弃转染6 h 后的培养基，补加10% FBS 的DMEM，将细胞置于CO2培养箱中培养。

1.5 rPPRV-B2L 盲传

rPPRV-B2L 盲传前一天，将VDS 细胞接种T25 细胞培养瓶，待次日盲传，细胞汇合度应为50%～70%。细胞共转染5～7 d后，将6孔板冻融1次，收获细胞培养液，2 000 r/min 离心5 min，收获上清。吸弃T25 培养瓶中VDS 细胞培养液，补加离心收获的上清。将培养瓶置于CO2培养箱内静置3～5 h，使重组病毒充分感染VDS 细胞。吸弃旧培养液，补加DMEM 培养基（含5% FBS、G418）继续培养。若盲传第1 代无明显细胞病变（cytopathic effect，CPE），则进一步盲传，直至出现典型CPE，即合胞体形成。待CPE 出现后，继续对重组病毒进行盲传，直至第7 代。

1.6 rPPRV-B2L 鉴定

收获第7 代病毒培养液，通过High Pure Viral Nucleic Acid Kit 抽提病毒核酸，采用PrimeScript ™One Step RT-PCR Kit 进行RT-PCR 鉴定。上游引物P-f：5'-AGCCATTCTTGCCAAGCAGCCGTAA-3'；下游引物P-r：5'-TATCAAAATCGTAGATCTCGGTCAT-3'。上下游引物退火位点如图1 所示。RTPCR 反应条件为：50 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30 个循环。为避免残留的cDNA clone 质粒对结果造成干扰，同时采用PrimeSTAR Max Premix 进行PCR 扩增作为对照，反应条件为：98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，共30 个循环。RT-PCR 和PCR 产物同时进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳阳性条带切胶后送青岛志远公司测序。

图1 rPPRV-B2L 拯救的四质粒反向遗传系统

1.7 rPPRV-B2L 生长曲线

将第7 代rPPRV-B2L 和第7 代rPPRV 同时进行生长曲线测定，然后比较二者的差异。将VDS 细胞接种于T25 培养瓶（4×106细胞/瓶），置于CO2培养箱培养2 h 后，将病毒接种VDS 细胞（MOI =0.01），继续置于CO2培养箱培养。分别于0、24、48、72、96 h 收集100 μL 上清液，立即进行TCID50分析，采用Spearman-Kärber 方法[13]进行病毒滴度测定，并将所测得结果绘制生长曲线。

1.8 B2L 蛋白Western blot 分析

将rPPRV-B2L 接种VDS 细胞（MOI=0.01），置于CO2培养箱培养72 h；收获细胞沉淀，用PBS 重悬后与loading buffer 混合，95 ℃孵育10 min，然后进行SDS-PAGE 电泳。将电泳后的凝胶进行半干转印，将转印后的膜依次进行TBST 漂洗3 次（10 min/次），无蛋白封闭液封闭1 h，一抗（B2L 蛋白单抗）封闭2 h，漂洗3 次（10 min/次），二抗（anti-mouse IgG-peroxidase）封闭1 h，漂洗3 次（10 min/次），Pierce ECL 化学发光底物处理、拍照。

1.9 B2L 蛋白质谱分析

为证实B2L 蛋白的表达，将B2L 蛋白在SDS-PAGE凝胶中对应的条带切下，送华大基因（北京）进行质谱分析。

2 结果

2.1 rPPRV-B2L cDNA clone 构建

利用In-fusion 试剂盒，通过同源重组方法构建的rPPRV-B2L cDNA clone 质粒，经测序证实核酸序列完全正确，其结构图如图1 所示。由于BSR-T7/5 细胞可以表达T7 RNA 聚合酶[14]，因此T7P 可以启动cDNA clone 转录；T7T 为T7 终止子（terminator），负责终止T7 转录[15]；HDV 作为核酶可剪切出精确的cDNA clone RNA 3'末端结构[16]。为增强B2L 蛋白的表达，在其开放阅读框上游添加Kozak 序列[17]。

2.2 rPPRV-B2L 拯救及盲传

将rPPRV-B2L cDNA clone、pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L 4 个质粒共转染BSR-T7/5细胞，以拯救重组病毒。BSR-T7/5 细胞在拯救过程中提供T7 RNA 聚合酶，但无CPE 产生。将病毒在VDS 细胞中连续盲传，第2 次传代72 h 后，便可观察到明显CPE，即合胞体形成（图2-B），而同期非感染细胞对照则无此现象（图2-D）。

图2 rPPRV-B2L 盲传第2 代72 h 导致的VDS 细胞病变

2.3 rPPRV-B2L 鉴定

对第7 代盲传病毒提取总核酸后进行RT-PCR分析，琼脂糖凝胶电泳结果如图3 所示。P-f/P-r引物对成功扩增了1 411 bp 目的片段，而PCR 对照则未出现扩增条带。将该目的条带切下测序，结果与目的核酸序列一致，说明已成功拯救了PPRV-B2L。

图3 第7 代rPPRV-B2L RT-PCR 分析结果

2.4 rPPRV-B2L 生长曲线

分 别 取0、24、48、72、96 h rPPRV-B2L 和rPPRV 感染的细胞上清，测定TCID50值，将所测结果绘制病毒生长曲线。生长曲线（图4）显示，在0～96 h 病毒感染细胞的培养周期内，rPPRVB2L 的复制速率稍低于rPPRV，但在感染96 h 时二者几乎达到同一生长滴度，约107TCID50/mL，说明外源基因的插入并未显著影响病毒的生长动力学特性。

图4 第7 代rPPRV-B2L 及同代次rPPRV 生长曲线

2.5 B2L 蛋白Western blot 分析

将rPPRV-B2L 感染72 h 后的细胞进行Western blot 分析，结果如图5 所示：在42 kD 处，两条rPPRV-B2L 泳道出现典型的B2L 蛋白印记带，而同一位置两条rPPRV 泳道未见类似条带，说明B2L 蛋白在胞内成功表达。

图5 B2L 蛋白表达的Western blot 分析结果

2.6 B2L 蛋白质谱分析

为证实B2L 蛋白的表达，切下SDS-PAGE凝胶中B2L 蛋白对应条带，送华大基因（北京）进行质谱分析。图6-A 为B2L 蛋白完整氨基酸序列，共379 aa，红色字体标注的氨基酸序列为质谱分析匹配肽段，占整个氨基酸序列的63%。5 个典型的质谱分析匹配肽段如图6-B 所示。质谱分析结果进一步证实了B2L 蛋白在胞内正确表达。

图6 B2L 蛋白表达的质谱分析结果

3 讨论

相对于麻疹病毒属其他成员反向遗传平台的构建[18-20]，PPRV 的研究报道相对较晚。Hu 等[21]于2012 年首次报道了表达绿色荧光蛋白的重组PPRV。由于PPRV 基因组cDNA clone 在构建过程中不稳定，较易发生突变或片段序列丢失现象，因此构建全长感染性克隆是制约病毒拯救的最大因素。解决该问题通常有两种方法：一是采用低拷贝数质粒构建cDNA clone（本研究采用了pBR322质粒作为骨架）；二是采用对质粒复制保真性更高的感受态细胞（本研究采用了HST16CR 细胞）。通过这两种方法构建cDNA clone，通常可解决突变或基因缺失问题。

在全长cDNA clone 中，外源基因的插入位点有多种选择，然而很难通过比较，筛选最佳的插入位点。按照以往的报道，P 和M 基因之间区域是最广泛使用的外源基因插入位点[22-26]，本研究亦如此。目前重组副黏病毒cDNA clone 的启动子通常有两种选择——T7 和CMV 启动子。本研究采用的是T7 启动子，需要有T7 RNA 聚合酶的作用才可启动转录。因此，本研究在拯救过程中采用的是表达该酶的细胞系（BSR-T7/5）。然而该细胞系不是PPRV 感染的敏感细胞，因此仅仅用作病毒拯救而不是传代。

病毒盲传过程中，通常第2 代或第3 代便可于显微镜下观察到明显的CPE。PPRV 的典型CPE表现为合胞体形成，因此若在盲传过程中观察到此现象，便可初步证明病毒拯救成功。接下来通过多次传代，收集病毒液提取总核酸，用于RT-PCR 分析，以证明病毒拯救是否成功。按照经验，通常盲传5 代之后，cDNA clone 质粒干扰便可消除，但在RT-PCR 鉴定过程中依然需设PCR 对照。本研究中，第7 代病毒的RT-PCR 检测呈阳性，PCR 对照为阴性，由此证明了重组病毒拯救成功。

外源基因的引入通常会在某种程度上影响病毒的复制效率，因此本研究比较了第7 代rPPRVB2L 和第7 代rPPRV 的生长动力曲线。为使比较结果更为准确，本研究未将rPPRV-B2L 与Nigeria疫苗毒株进行比较，而是与同代次Nigeria 疫苗株的拯救毒株进行比较。随着传代次数的增加，病毒将越来越适应细胞[27]，换言之，其在胞内的复制效率也将逐步升高，因此确保选择同代次的两种病毒，是比较二者复制动力学的前提。

本研究的目的是构建表达B2L 蛋白的重组PPRV，因此需对B2L 蛋白的表达进行验证。首先以B2L 蛋白单抗作为一抗进行Western blot 验证，结果发现rPPRV-B2L 泳道出现B2L 蛋白印记带，而rPPRV 对照则没有，说明rPPRV-B2L 可有效表达B2L 蛋白。为验证B2L 蛋白的表达，本研究曾以B2L 蛋白单抗作为一抗，对rPPRV-B2L 感染的VDS 细胞进行间接免疫荧光分析，然而荧光显微镜下并未出现预期的荧光现象。这可能与B2L 蛋白单抗有关，因为识别线性表位的单抗有时不应用于细胞的免疫荧光分析，换言之，单抗识别的线性表位可能会被胞内目的蛋白复杂的空间结构所掩盖。因此，为进一步证实蛋白的表达，本研究又进行了蛋白质谱分析，发现质谱结果与B2L 蛋白全长氨基酸序列的匹配度达到63%，这进一步证实了B2L 蛋白的表达。

羊口疮和小反刍兽疫是山羊和绵羊常见的两种病毒性传染病，二者甚至在同一地区同时流行。目前防控两种疫病的有效疫苗皆为弱毒疫苗，但临床未见二联疫苗使用的报道。本研究通过反向遗传技术构建了表达B2L 蛋白的重组PPRV，为羊口疮和小反刍兽疫二联疫苗研制奠定了基础。

致谢：

特别感谢黑龙江八一农垦大学于永忠老师对于B2L 蛋白单抗的惠赠。