病死猪圆环病毒2 型检测及全基因序列分析

高志强，汪 琳，赵相鹏，蒲 静，尹 羿，尹立勇，张 伟，任 彤

（1.北京海关技术中心，北京 100026；2.顺义区动物卫生监督所，北京 101300）

猪圆环病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）是一种重要的猪病病原，于1997 年在加拿大被首次发现，随后在大多数养猪国家被发现。PCV2 可引起猪的多种病症，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴结炎等。PCV2 感染还可造成猪群免疫力下降，导致多种疫苗免疫失败，猪只死亡率升高，因此对养猪业危害巨大[1]。PCV2 为圆环病毒科圆环病毒属成员，无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小为1 767～1 768 nt，包含2 个开放阅读框（ORF），分别为ORF1 和ORF2。其中ORF1 编码复制相关蛋白（Rep 和Rep'），ORF2编码病毒衣壳蛋白（Cap）。ORF2 为病毒主要结构蛋白编码基因，也是核酸扩增检测的主要靶区域[2]。

PCV2 变异的研究表明，由于遗传变异导致目前国内PCV2 存在多种不同基因型。一些研究表明，PCV2 基因序列差异与分离地域相关，与致病性相关性不大。21 世纪以来，世界范围内PCV2 的优势基因型持续发生变异，其中基因型 PCV2b 流行最广泛且其致病性增强。一些报道也表明，Cap 基因一个单核苷酸的缺失突变可引起Cap 蛋白的延长。目前国际上根据ORF2 序列的遗传距离，即达到0.035 时，判定为不同基因型，从而将PCV2 分为3个基因型，分别为PCV2a、PCV2b 和PCV2c。其中，PCV2a、PCV2b 在猪群中广泛流行，而PCV2c仅在20 世纪80 年代在丹麦有报道，目前没有流行。近年来国内又报道了新的基因型PCV2d[3-4]。

本研究通过对国内外流行的3 个基因型（PCV2a、PCV2b 和PCV2d）毒株序列进行比对研究，建立了灵敏特异的PCV2 通用型荧光PCR 检测方法。用此方法从北京顺义区动物卫生监督所查获送检的2 批次病死猪的多脏器中检出PCV2，为进一步了解检出PCV2 病毒的基因特征，对3 份不同批次样品中分离的病毒进行了全基因组扩增检测分析，经进化分析确认为PCV2b 和PCV2d 基因型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒核酸及被检样品 猪瘟病毒HCLV cDNA、 伪 狂 犬 病 毒Nanyangju 核 酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV RespPRRS/Repro cDNA、 猪 传 染 性 胃 肠 炎 病 毒Purdue115 cDNA、PCV2 QD 株DNA，均为本实验室保存；人工合成含有PCV2 完整ORF2 基因（AY391729），克隆于质粒pBluescript II SK（+）；被检样品，来自2017 年4 月—12 月采集的45 份病死猪脏器，由北京市顺义区动物卫生监督所送检。

1.1.2 主要试剂 血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304），购自天根生化科技有限公司；Ex HS Taq DNA 聚合酶、dNTP 等，购自TaKaRa 公司；核酸纯化柱及套管，购自上海生工。

1.1.3 主要设备 LightCycler 480，购自Roche 公司；AB 9700，购自AB 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针合成 随机选取国内存在的3个基因型（PCV2a、PCV2b 和PCV2d）毒株序列，在序列比对基础上，针对ORF2 设计合成1 套荧光PCR 引物探针，用于样品检测。探针序列比较结果见图1。同时依据文献合成一对反向交叉引物，用于扩增PCV2 全基因组[4]。引物探针名称、序列及靶基因见表1。

图1 引物探针设计区域的序列比对结果

表1 引物探针的名称、序列及靶基因

1.2.2 荧光定量PCR 反应条件优化 用ROCHE480 设备进行反应体系优化，对反应参数、各种成分的浓度进行优化。

1.2.3 灵敏度试验 应用建立的反应体系，对人工合成的含101～105基因拷贝的PCV2 DNA 进行检测，以验证方法的灵敏度。

1.2.4 特异性试验 应用建立的反应体系，对猪瘟病毒HCLV cDNA、 伪狂犬病毒Nanyangju核酸、 猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV RespPRRS/Repro cDNA、猪传染性胃肠炎病毒Purdue115 cDNA、PCV2 QD 株DNA 进行检测，以验证方法的特异性。

1.2.5 送检样品检测 应用建立的方法，对北京市顺义区动物卫生监督所送检的总计45 份病死猪脏器样品进行检测，同时与行业标准SN/T 2708—2010 推荐的套式PCR 方法进行比较[5]。

1.2.6 PCR 扩增强阳性样品全基因序列 使用表1中的引物对PCV2-F/PCV2-R，进一步对分属2 批次的3 份样品进行扩增。采用50 μL 体系，每个反应体系均包含1×PCR Buffer、3.0 mmol/L MgCl2、200 nmol/L dNTP、0.8 μmol/L 的PCV2-F/ PCV2-R引物、2.5 U Taq DNA 聚合酶、5 μL 模板DNA。反应参数为95 °C/3 min；94 °C/30 s，61 °C/30 s，72 °C/min，40 个循环；72 °C 最后延伸10 min。扩增后取PCR 产物5 μL 用2%琼脂糖凝胶进行电泳。1.2.7 目的片段克隆、测序 将PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段，按照说明书克隆入pGEM-T 载体，转化Top10 感受态细胞，每个阳性质粒各挑取3 个克隆进行序列测定。对ORF2 基因序列和推导氨基酸序列进行变异分析，将测定获得的3 个全基因序列与NCBI 选取的21株代表性PCV2（涵盖PCV2a、PCV2b、PCV2c 以及PCV2d）全基因序列对比，使用MEGA 4.0 绘制进化树，确定测定序列的基因型。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR 反应条件优化

经优化确立反应体系：每个反应体系均包含1×Ex Taq HS PCR Buffer、200 nmol/L dNTP、0.2 μmol/L 的PCV2-BF/PCV-BR 引 物、0.1 μmol/L的PCV2-P 检测探针。反应参数为95 °C /3 min，94 °C/10 s，60 °C/30 s，40 个循环。每个循环60 °C时收集荧光信号。

2.2 灵敏度试验

应用建立的反应体系可以检出10 拷贝的病毒DNA，表明方法的灵敏度可以满足要求（图2）。

2.3 特异性试验

应用建立的反应体系检测，对猪瘟病毒HCLV cDNA、伪狂犬病毒Nanyangju 核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV RespPRRS/Repro cDNA、猪传染性胃肠炎病毒Purdue115 cDNA、PCV2 QD 株DNA 进行检测，结果发现建立的检测方法仅能检出PCV2 QD 株DNA。

图2 灵敏度试验结果

2.4 送检样品检测

应用荧光PCR 检测方法，从2 批次45 份病死猪脏器中检出25 份阳性，与基于凝胶电泳的套式PCR 方法比较发现，仅有2 份样品的检测结果不一致，两种检测方法的复合率为95.6%。具体结果见表2。

表2 样品检测结果 单位：份

2.5 强阳性样品病毒基因组扩增与克隆

对3 份强阳性样品采用PCV2-F 和PCV2-R 引物，经PCR 扩增了全长PCV2 基因组DNA，（图3）并将其克隆入pGEM-T 载体，质粒DNA 转化Top 10 感受态细胞，经菌落PCR 鉴定后，证明3个PCV2 基因组DNA 成功克隆入质粒载体，分别命 名 为pGEM-T-PCV25101、pGEM-T-PCV21201和pGEM-T-PCV215102。

图3 3 个样品PCV2 基因组DNA 扩增结果

2.6 序列测定与变异分析

测序结果经blast 分析显示，目的片段均为PCV2 DNA，与预期一致，长度均为1 768 nt。其 中：PCV21201 和PCV215102 序 列 相 似 性 较高，为99.7%；PCV25101 与其他2 个全基因序列差异相对较大，序列相似性分别为95.9%和95.7%。对ORF2 推导氨基酸序列进行比对，同样是PCV21201 和PCV215102 序列相似性较高，为99.1%；PCV25101 与其他2 个全基因序列差异相对较大，序列相似性分别为94.4%和93.6%，因末端T 突变为C，导致终止密码子后移，编码的氨基酸比PCV21201 和PCV215102 多出1 个赖氨酸（图4）。

2.7 进化分析和亲缘性分析

图4 ORF2 推导氨基酸序列比对结果

将测定获得的3 个全基因序列与NCBI选 取 的21 株 代 表 性PCV2（ 涵 盖PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d）全 基 因 序 列，使用MEGA 4.0 绘制进化树，确定测定序列的基因型。结果显示：PCV21201 和PCV215102基 因 型 为PCV2b， 而PCV25101 基 因 型 为PCV2d（图5）。

图5 24 个PCV2 全基因序列的进化分析结果（包括本研究获得的3 个序列）

3 讨论

近十多年来，PCV2 感染对我国养猪业危害巨大，有关PCV2 的检测和病毒基因变异研究在全球广泛开展。但国内有关PCV2 基因变异的研究还不是很多。因此在日常检疫工作中，对阳性结果的基因序列进行分析，不仅能确认检测结果，而且对充分了解国内PCV2 的变异具有一定意义，也有助于猪圆环病毒病的防控。

本研究中，与随机选取国内外流行的3 个基因型（PCV2a、PCV2b 和PCV2d）毒株序列进行比对，在此基础上设计通用型引物探针，建立和优化反应体系，并评估其敏感性和特异性，并用于送检样品的检测。从2 批次45 份病死猪脏器中检出25 份阳性，与出入境检验检疫行业标准中的套式PCR 方法比较，复合率达到95.6%。由于PCV2c仅在上世纪80 年代在丹麦有报道，目前没有流行，因此在建立方法时并未参考该基因型的毒株序列。但考虑到目前相关荧光PCR 检测标准方法的检测目标也未针对PCV2c，下一步开展能覆盖4 个基因型毒株的荧光PCR 方法用于本病的检测对于本病的防控检测会更有意义。此外，从2 批次的3 份PCV2 强阳性样品中扩增了3 个全基因序列，经序列分析显示，2 个批次中获得的3 个全序列中，1个（第2 批次）与另外2 个（第1 批次）差异明显，分别属于PCV2b 和PCV2d。

ORF2 编码的Cap 蛋白是PCV2 的主要结构蛋白和保护性抗原，尽管该蛋白基因相对保守，但近年来不断发生变异。该基因的变异可导致蛋白C末端多出1～2 个氨基酸。Knell 等[6]曾报道1 042处缺失1 个T 可致蛋白C 末端多出1 个赖氨酸。Olvera 等[7]报道ORF2 终止密码子的突变也可导致C 末端多出1 个赖氨酸，Guo[4]等也发现这一现象。本研究通过全基因测序鉴定出了PCV2d 基因型序列。该基因型病毒株ORF2 的一个碱基突变，致长度发生改变，与上述研究结果一致。此变异与病毒致病性的关系还有待于进一步研究。