楮实子对药物性肝损伤大鼠氧化应激因子的影响

王 茜，张一昕，石 铖，郝 蕾，韩 雪，郭秋红，张晓栋

河北中医学院药学院，河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，石家庄 050200

药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是指药物或其代谢产物引起的肝细胞毒性损害或肝脏对药物及代谢产物的变态反应所致的疾病。据报道，DILI已成为国内外常见且较严重的药源性疾病之一[1]。研究表明，氧化应激在药物性肝损伤的发病中具有重要作用，而过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARS)与氧化应激关系密切。过氧化物酶体增殖物激活受体a(peroxisome proliferators activated receptor alpha，PPAR-a)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPAR-γ)属于细胞核受体家族，其功能状态与肝脏相关疾病(如脂肪肝、肝炎、肝硬化和肝癌)的发生密切相关[2]。

中医学认为，药物性肝损伤是药毒侵犯机体，湿热毒邪蕴结体内，影响肝胆的正常疏泄功能，从而导致胁痛、黄疸等症状。楮实子(Broussonetiae Fructus)为桑科植物构树Broussonetiapapyrifera(L．)Vent．的干燥成熟果实，主入肝经，味甘性寒无毒，具有益阴清肝、利水消肿的功效。根据DILI湿热毒邪的病机，楮实子通过清肝，利水消肿的作用能有效去除湿热邪毒，且现代研究报道，楮实子具有保肝及较强的体外抗氧化作用[3,4]。因此，本文拟通过观察肝功能指标，揭示楮实子对药物性肝损伤的保护作用，通过检测氧化应激指标及PPAR-a和PPAR-γ的基因表达情况，初步探讨楮实子可能的作用途径，为保肝新药的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，体质量180 ～ 220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：11400700181914，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。

主要试剂与试剂盒：谷丙转氨酶(ALT，批号AUZ3689)和谷草转氨酶(AST，批号AUZ3645)测定试剂盒均购自贝克曼库尔特实验系统有限公司；总胆红素(TBIL，批号A005)和直接胆红素(DBIL，批号A006)试剂盒均购自长春汇力生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD，批号A001-1)，谷胱甘肽(GSH，批号A006-1)，丙二醛(MDA，批号A003-2)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，批号A005)，过氧化氢酶(CAT，批号A007-1)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Trizol(批号：139603)，购自invitrogen公司；TIANScriptcDNA第一链合成试剂盒(批号：P5011)，SuperRealPreMix Plus(SYBR Green，批号：Q5922)均购自天根生化科技(北京)有限公司；Anti-ROS1 Rabbit Polyclonal Antibody(批号：D829AA0353)，购自ORIGENE公司。

主要仪器：Humalyzer2000 半自动生化分析仪(德国豪迈公司)、HMIAS-2000显微图像分析系统(武汉同济大学)、荧光定量PCR仪ABI7500(Applied Biosystems)、DP73数码显微镜(日本 Olympus)。

1.2 实验方法

1.2.1 楮实子药液制备

楮实子(CSZ)选用广东一方制药有限公司生产的中药配方颗粒(批号为:11080711，当量比为7∶1)，实验时将楮实子的实验用生药剂量按照当量比换算为配方颗粒的剂量，用100 ℃ 蒸馏水充分溶解，冷贮备用。

1.2.2 动物分组与造模

将 50只 SD 大鼠适应性喂养 1 周后，按体重随机分为5组，每组 10只，即:正常组、模型组、水飞蓟宾组、楮实子低、高剂量组 (简称低剂量组、高剂量组)。除正常组给予蒸馏水灌胃以外，其余各组用对乙酰氨基酚溶液1 200 mg/kg(用40 ℃生理盐水配制)每日灌胃1次，连续30天。

1.2.3 给药方法

从造模第 1 天起，上午造模，下午正常组和模型组给予蒸馏水灌胃，阳性药和楮实子各剂量组均给予相应药物。结合临床应用，选择临床成人1日常用剂量10 g作为楮实子低剂量，40 g作为楮实子高剂量，按照人与大鼠体表系数法转换为实验用量，低、高剂量组大鼠每日用药剂量分别为1.05、4.2 g生药/kg；水飞蓟宾组为44 mg/kg。每次用药体积均为1 mL/100 g，连续给药30 天，自由进食水，每5 天称体重一次，根据体重更换灌胃体积。

1.2.4 样本制备及相关生理生化指标检测

最后一次灌胃给药后，各组大鼠禁食不禁水16 h，3.5% 水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，分别置于洁净试管和肝素抗凝管中，4 000 rpm，离心20 min，分离血清和血浆，采用全自动生化分析仪检测ALT和AST活性、DBIL和TBIL含量；采用紫外分光光度仪按照南京建成试剂盒说明书测定血清中SOD、GSH-PX 和CAT的活性，GSH和MDA的含量。各组大鼠取血后，迅速剖腹取出肝脏，分成若干小块，取一部分置于4% 多聚甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，HE 染色，光镜观察肝组织的形态学变化，运用免疫组化法检测ROS1的蛋白表达；再取一部分置于冻存管中液氮冻存，-80 ℃冰箱保存，RT-PCR技术检测肝组织中PPAR-γmRNA、PPAR-αmRNA的表达。

1.2.5 RT-PCR

称取100 mg肝脏组织，磨碎，加入Trizol 1 mL，冰上匀浆，提取总RNA。参照逆转录试剂盒说明进行逆转录反应，获得cDNA。取5μL RNA用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，以检测其完整性。将完整的cDNA 进行实时荧光定量 PCR 反应，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60～95 ℃进行溶解曲线分析，检测PPAR-γ、PPAR-α的基因表达，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。β-actin上游引物5′-CCTCCTGAACTTGAGGCAGTTTA-3′，下游引物5′-CTCTGGGGCTGTCAGTCTTG-3′，PPAR-α上游引物为5′-GAAAGATTCGGAAACTGC-3′，下游引物为5′-TCCTGCGAGTATGACCC-3′；PPAR-γ上游引物为5′-TGGGCGAATGCCACAGG-3′，下游引物为5′-TTTGGTCAGCGGGAAGG-3′。

1.2.6 免疫组化

将多聚甲醛固定的肝组织制作成病理蜡块，切片后按照试剂盒说明用免疫组化法观察ROS1的阳性表达，通过软件分析所测阳性反应物相对含量的灰度值及面积，由积分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)来表示。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS13.5软件进行处理，计量资料多组间比较采用方差分析，方差齐选用LSD，方差不齐选用非参数检验方法；以P<0.05 有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 楮实子对APAP肝损伤大鼠血清肝功能指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中ALT 和AST活性、DBIL含量均明显升高(P<0.05或P<0.01)、TBIL含量有升高趋势，但无统计学差异(P>0.05)。药物干预后，各用药组ALT和AST活性，DBIL和TBIL的含量均较模型组降低。其中水飞蓟宾组和低剂量组ALT、AST活性降低明显(P<0.05或P<0.01)，高剂量组AST活性及DBIL含量显著降低(P<0.05或P<0.01)；与高剂量组比较，楮实子低剂量组AST活性的降低更明显(P<0.05)(见表1)。

表1 楮实子对APAP肝损伤大鼠血清ALT、AST、DBIL、TBIL的影响

注：与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与高剂量组比较，※P<0.05。

Note:Compared with normal group,△P<0.05，△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with high dose group,※P<0.05.

2.2 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织病理形态学的影响

正常组大鼠肝小叶结构完整，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列整齐，肝细胞形态正常，未见明显病理改变。模型组肝小叶结构破环,肝索排列紊乱，广泛性肝细胞气球样变并伴有坏死。水飞蓟宾对照组和楮实子各给药组大鼠仅在中央静脉周围出现局部的肝细胞气球样变。尤其是水飞蓟宾对照组和低剂量楮实子组肝损伤程度最轻，仅出现个别肝细胞气球样变情况(见图1)。

图1 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织病理形态学的影响(HE,100×)Fig.1 Effects of CSZ on the morphology of mouse liver tissues(HE,100×)注：1.正常组；2.模型组；3.水飞蓟宾组；4.楮实子低剂量组；5.楮实子高剂量组。Note:1.Normal;2.APAP;3.APAP+silymarin;4.APAP+CSZ (1.05 g/kg);5.APAP+CSZ (4.2 g/kg).

2.3 楮实子对APAP肝损伤大鼠氧化应激指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中MDA含量显著升高(P<0.01)，GSH含量、SOD和GSH-PX活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，水飞蓟宾组MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.01)；高、低剂量楮实子组GSH含量、SOD和GSH-PX活性均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与水飞蓟宾组比较，低剂量组GSH含量显著升高(P<0.01)。各组CAT活性无明显统计学差异(P>0.05)。见表2和表3。

表2 楮实子对APAP肝损伤大鼠血清MDA、GSH含量的影响

注：与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与水飞蓟宾组比较，☆☆P<0.01。

Note:Compared with normal group,△P<0.05，△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01.

表3 楮实子对APAP肝损伤大鼠血清SOD、 GSH-PX、CAT活性的影响

注：与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

Note:Compared with normal group，△P<0.05;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01.

2.4 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织中PPAR-α、PPAR-γ mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组、水飞蓟宾组、高、低剂量楮实子组PPAR-αmRNA表达水平均显著降低(P<0.01)，PPAR-γmRNA表达水平升高，其中模型组、水飞蓟宾组、低剂量组表达升高有统计学差异(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，水飞蓟宾组、高、低剂量组PPAR-αmRNA表达水平均升高，PPAR-γmRNA表达水平均降低，其中高、低剂量组的调控作用尤为明显(P<0.01)；与水飞蓟宾组比较，高、低剂量组PPAR-αmRNA表达水平均显著提高(P<0.01)、PPAR-γmRNA表达水平均降低(P<0.01)；与高剂量组比较，低剂量组PPAR-αmRNA表达水平降低(P<0.05)(见表4)。

表4 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织中PPAR-α、PPAR-γ mRNA表达的影响

注：与正常组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与水飞蓟宾组比较，☆☆P<0.01；与高剂量组比较，※P<0.05。

Note:Compared with normal group,△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01;Compared with high dose group,※P<0.05.

2.5 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织中ROS1表达的影响

正常组阳性细胞表达相对较少，着色较浅，模型组大鼠肝组织的细胞阳性表达相对较多，着色较深。对照组、低、高剂量楮实子组阳性细胞的表达及着色程度降低。模型组大鼠肝组织中IOD和MOD较正常组升高(P<0.01或P<0.05)；各用药组IOD和MOD均低于模型组(P<0.01或P<0.05)，其中，IOD高、低剂量组高于对照组(P<0.01)，高剂量组低于低剂量组(P<0.01);MOD高、低剂量均高于对照组，但无统计学意义(P>0.05)(见表5，图2)。

表5 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织中ROS1蛋白表达的影响

注：与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01与水飞蓟宾组比较，☆☆P<0.01；与高剂量组比较，※※P<0.01。Note:Compared with normal group,△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01;Compared with high dose group,※※P<0.01.

3 结论

ALT 和 AST 是临床应用最广泛的反映肝细胞损伤的生化指标，但在药物性肝损伤的早期诊断及识别方面具有一定的局限性[5]。有文献报道，胆红素增高是药物性肝炎死亡及肝衰竭的最佳预测指标。TBIL和DBIL的正常代谢依赖于肝细胞,当肝脏发生炎症、坏死、中毒等损害时，一方面肝脏无法完全摄取和结合 TBIL，另一方面肝细胞内的 DBIL会从受损的肝细胞释出，因此导致血液中 DBIL和 TBIL 均升高[6]。本实验结果显示，与正常组比较，模型组AST、ALT活性和DBIL含量显著升高，肝细胞变性、坏死，提示药物性肝损伤模型成功。采用不同剂量的楮实子给药，结果显示楮实子各剂量组血清 ALT、AST活性和DBIL、TBIL含量降低，肝细胞变性程度较模型组减轻，表明楮实子对药物性肝损伤有良好的修复作用。

图2 楮实子对APAP肝损伤大鼠肝组织中ROS1蛋白表达的变化(免疫组化，200×)Fig.2 Effects of CSZ on the expression of ROS1 protein in the liver of rats(SP,200×)注：1.正常组；2.模型组；3.水飞蓟宾组；4.楮实子低剂量组；5.楮实子高剂量组。Note:1.Normal;2.APAP;3.APAP+silymarin;4.APAP+CSZ (1.05 g/kg);5.APAP+CSZ (4.2 g/kg).

文献报道氧化应激是对乙酰氨基酚导致肝损伤的重要机制[7]，对乙酰氨基酚 (APAP)过量可引起线粒体氧化损伤、肝细胞坏死，从而导致急性肝衰竭。而作为脂质过氧化反应的终产物之一，MDA是机体内反映氧化损伤程度的经典指标之一。同时肝脏还有多种抗氧化物酶，可抵抗自由基损伤，如SOD、CAT和GSH-Px共同形成抗氧化物酶体系[8]。GSH是一种低分子自由基清除剂，又是GSH-Px的底物，能防止细胞因子受氧化损伤。脂质过氧化作用将活性氧转化为活性化学剂，通过链式或链式支链反应放大活性氧的作用，同时由于活性氧积聚，使肝组织的抗氧化物质消耗增加，使SOD 、CAT、 GSH-Px、GSH表达量下降[9]。实验结果表明，模型组大鼠肝组织 MDA 含量高于正常组，SOD 、GSH-Px和GSH水平明显低于正常组，提示肝损伤大鼠有脂质过氧化损伤及抗氧化物酶体系的减弱。而楮实子各剂量组的肝组织 MDA 含量低于模型组，SOD 、GSH-Px和GSH水平高于模型组，提示其具有抗氧化，清除自由基的作用。

ROS1是Ⅱ类受体酪氨酸激酶的胰岛素受体基因，被认为是多种信号通路的启动因子，在正常的机体状态下其被严格控制不发挥作用，一旦受到致病因子的刺激，则可诱导细胞发生氧化应激反应[10]。因此，ROS1可认为是氧化应激发生的一个启动因子，如果能抑制ROS1的表达，则可延缓或抑制氧化应激的发生发展过程。PPAR-α和PPAR-γ均是配体活化的转录因子，属于核激素受体超家族成员。近年来研究发现，PPAR-α及其配体对氧化应激诱导的药物性肝损伤有良好的调控作用，激活 PPAR-α可抑制肝细胞缺氧/复氧损伤的脂质过氧化反应，减轻大鼠肝细胞缺氧/复氧损伤的氧化应激损伤，保护肝功能。PPAR-γ可被特异性配体激活而在细胞增殖分化、炎症调控、凋亡、抑制肝脏氧化应激过程中发挥重要作用[11-13]。刘芳等研究发现，PPAR-γ的表达在 LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤模型组中显著增高，与以往研究结果相反，认为在急性肝损伤中PPAR-γ的表达升高可能是一种应激性反应[14]。另有文献报道，肝细胞中PPAR-γ的表达可抑制脂代谢，促进肝脏脂肪变性[15]。本文结果显示，模型组大鼠ROS1蛋白表达以及PPAR-γ基因表达高于正常组，而PPAR-α基因表达低于正常组，楮实子各剂量组ROS1蛋白的表达和PPAR-γ基因表达均有不同程度的降低，PPAR-α基因表达基因表达有不同程度的升高，以高剂量组效果较好。

综上所述，楮实子能有效防治对乙酰氨基酚所致肝损伤，其机制可能与ROS1蛋白控制了氧化应激的启动，转录因子PPAR-α对药物性肝损伤所发生的氧化应激起到正向调控的作用，PPAR-γ则为反向调控的作用，结合文献报道分析PPAR-γ是否对氧化应激性损伤发挥保护作用有争议，一方面认为PPAR-γ过表达为机体抗炎的应激性反应。另一方面，PPAR-γ过度表达通过抑制脂代谢，促进肝脏脂肪变性。因此，后续实验会选择加入PPAR-γ的激动剂或抑制剂，设置不同的对乙酰氨基酚给药时间、给药剂量，观察氧化应激、炎性因子、脂质代谢、PPAR-γ等指标的变化，以期最终揭示楮实子对PPAR-γ的反向调控是否为保肝作用的机制。