马尾松种质资源遗传多样性的RAPD 分析

侯晓奎 李元应

（黄河交通学院，河南 武陟 454950）

马尾松是我国重要的用材和绿化树种之一，其遗传多样性是良种选繁的基因基础。因此，对马尾松种质资源遗传多样性的研究具有非常重要的现实意义。

1 目的和意义

拟采用RAPD 标记技术，分析和研究了35 份不同地域和纬度的马尾松种源遗传变异情况和数据，为马尾松核心种质资源库的建立奠定良好的物质基础，对马尾松种质资源的保护与可持续开发利用，具有重要的理论和现实意义。

2 材料与方法

2.1 材料

供试验的35 份马尾松种质资源材料，全部来自三明市大田县桃源国有林场试验基地。2018 年3 月，从林场种质资源试验基地中，每个种源抽选5 株，采集刚抽生的嫩梢，冷藏于-20℃冰箱中保存，供提取其DNA 使用。

2.2 仪器与试剂

RAPD 引物选用生工生物工程（上海）有限公司的S 系列引物，TaqDNA 聚合酶、dNTPs（dNTP Mix）购自深圳市基因谷科技有限公司；PCR 扩增仪为M J Reareh PTC-200，电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-Ⅱ型，凝胶成像系统为Bio-Rad 凝胶成像系统。

2.3 方法

2.3.1 DNA 提取与检测。采用CTAB 法提取DNA，从提取的DNA 样品中取出10μL，稀释到1000μL，然后在UV-7504型紫外分光光度计检测DNA 的纯度、浓度和产率，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。

2.3.2 RAPD-PCR 扩增反应与优化。RAPD-PCR 扩增反应体系25μL，内含50ng 模板DNA，2.0mmol/LMgCl2，0.8μmol/L引物，0.25mmol/LdNTPs，1UTaqDNA 聚合酶，1×buffer 缓冲液。再选择一个基本扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，36.5℃退火1min，72℃延伸2 min，45 个循环；72℃延伸7 min，退出。

随机抽取同样株的DNA 为模板，以TaqDNA 聚合酶、引物浓度、DNA 模板浓度、Mg2+浓度、dNTP 浓度为优化因子，分别设置不同的梯度，S91（5'-TGCCCGTCGT-3'）作为本优化试验的引物。优化时保持基本扩增体系不变，在基本扩增程序上，每次只改变1 个扩增参数进行扩增。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶于3V/cm 电场中电泳，染色，观察、记录、分析并拍照。

2.3.3 RAPD-PCR 扩增反应引物筛选。选择差异性较大的3份DNA 样品，以前面筛选出的RAPD 扩增程序和扩增体系，用所选购的200 条随机引物进行RAPD 扩增试验，从中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物用于马尾松种质资源的RAPD 分析。

3 结果与分析

3.1 RAPD-PCR 最佳反应体系与反应程序确立

通过筛选TaqDNA 聚合酶用量、引物浓度、模板DNA 浓度、Mg2+浓度、dNTPs 浓度等因子，RAPD-PCR 较为理想的扩增体系为：在扩增反应总体积25μL 中，包含25ng 模板DNA，2.5mmol/LMgCl2，0.8μmol/L 引 物，0.16mmol/L dNTP，1.0UTaqDNA 聚合酶，1×Buffer 缓冲液。通过优化热循环参数，较为理想的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，45 个循环；72℃延伸7 min 退出。

3.2 扩增结果统计及谱带分析

用前面优化出的RAPD 反应条件，从需要分析的样品中抽取3 份DNA 样品作为模板，对S 系列的200 条随机引物进行PCR 扩增试验。从该200 条随机引物中筛选出了18 个可用于马尾松RAPD 分析的随机引物。引物号及序列见表1。

经过统计，用筛选出来的18 个RAPD 引物对35 份马尾松样品进行扩增试验，共检测到153 个条带，其中多态位点为137 个，多态位点百分率为89.5%。每个引物检测到的条带数介于4～17 条，平均每个引物为8.5 条，不同引物的扩增片段长度在300～3800bp。其中扩增位点最多的是S66，S91和S150，分别扩增出的位点数为17，15 和15。扩增位点最少的是S65 和S141，仅扩增出4 条清晰的条带。这证明了RAPD 可以准确检测出马尾松种质资源的遗传多样性。引物S66 的RAPD 扩增谱带（如图1）。

图1 RAPD 标记中S66 号引物扩增出来的DNA 谱带

表1 RAPD 分析所用引物及其扩增谱带数

3.3 遗传多样性分析

在对不同引物的扩增产物试验过程中，仅有个别品种或单株在其某一片段长度处（位点）有条带出现，这种其他品种或单株所不具备的条带，可作为该品种或单株的特殊RAPD标记。本试验共获得8 条引物的共13 条RAPD 特异带（见表2），这些标记是某一品种或单株的特有条带，是进行特殊性状标记的基础。通过比较条带存在与否、条带的多少及带型的差异可发现不同品种或单株之间的差异、遗传多样性和亲缘关系。

利用SPSS11.5 的聚类分析功能分析35 份样品的RAPD扩增所得到的谱带数矩阵，计算各样品间的遗传相似系数（GS），从遗传相似系数来看，马尾松种质资源遗传多样性较为丰富。35 份供试样品两两之间的GS 值在0～1，平均为0.494。其中福建三明和福建闽清之间的遗传相似系数最大，为1，说明两者之间的遗传基础相似，亲缘关系非常接近。安徽屯溪与安徽潜山、广西忻城与福建武平、湖南江永与江西靖江、湖北红安与湖南常宁两两之间的相似系数分别为0.981、0.960、0.929、0.921，均高于0.92，说明二者在基因组组成和核苷酸序列上极为相似。而四川南江与江西靖江遗传相似系数最小，为0，即遗传距离为1，表明它们之间的亲缘关系最远。同时福建邵武与其它34 份样品的遗传相似系数均在低于0.352，且仅与3 个样品大于0.3，说明与其它样品间的差异最明显。

表2 RAPD 扩增的特异引物和特异标记

4 结论与讨论

从筛选出来的18 个RAPD 引物对35 份马尾松种质资源进行了DNA 扩增试验，共检测到153 条RAPD 标记条带，其中多态性带137 条，多态性百分率为89.5%，不同引物的扩增片断长度在300～3800bp，平均每个引物检测到的条带数为8.5 条。不同引物的扩增片断的数目及其多态性程度均不同，但都呈现出了丰富的多态性，证明了RAPD 可以准确检测马尾松种质资源的遗传多样性。采用聚类分析发现遗传关系，仅由种质材料来源区域的远近和生产上品种的名称判断很难得到准确信息。

因此，只有借助于各种新的分子层级水平的检测手段才能取得更加有效、更加准确的分析和评估，为资源保护利用和育种选繁实践提供有力的支撑。鉴于RAPD 标记存在一定的局限性，下一步应逐步尝试使用其他的分子标记技术手段，如ISSR、AFLP 进行更深层次的分析。