墨红玫瑰花中鞣质的提取方法

陶冬冰，张 旋，张 琦，张佰清

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866）

墨红，学名Rose chinensis Jacq“Crimsin Glory”H.T.，又名朱墨双辉，从法国引种栽培，该品种花大色艳、香气浓郁，花瓣厚而多[1]，由于云南气温适合周年生长，花期可达8个月，加上云南高原的紫外线照射，其天然色素与香精的含量非常高，极具经济价值和观赏价值，目前在昆明、玉溪、楚雄等地都有成片的栽培，规模可达到3 km2。

鞣质是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。植物鞣质在自然界分布极广，从含鞣质的植物性物料中提取的产品可以用作制革鞣剂、木材胶黏剂、选矿抑制剂、防垢除垢剂、金属络合剂等，从而广泛应用于制革、石油开采、木材加工、采矿、涂料、水处理等行业[2-5]。随着对鞣质生理活性研究的开展，鞣质被广泛应用于医药、食品、化工等领域，鞣质可作为天然的食品添加剂，可以调节食品风味，同时起到一种高效、无毒且具有保健性的抗氧化和防腐蚀作用[6]。鞣质也具有抗衰老、抗紫外线、增白及保湿作用等，可用于护肤品、染发剂、牙膏、祛臭剂等日用化学品中作为活性成分[7-13]。试验以法国墨红玫瑰为原料，利用溶剂浸提、超声波辅助提取、超临界CO2萃取技术提高提取鞣质的效率，优化玫瑰鞣质的提取工艺，并为今后鞣质的生理活性研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

试验材料为新鲜的玫瑰花，品种为法国墨红玫瑰，采于云南七彩云花生物科技有限公司食用玫瑰花基地。

Conc 50型紫外可见分光光度计（瓦里安）、CR21G型高速离心机（日立）、HA121-50-02型超临界萃取设备、KQ5200DE型超声波清洗（昆山超声）、Labconco Freezone2.5型真空冷冻干燥设备等。

1.2 试验方法

1.2.1 鞣质的提取方法

（1） 工艺流程。墨红玫瑰花→原料预处理（去除花托、留完整花瓣）→烘干→粉碎→预处理（过筛、脱脂）→提取（浸提、超声波辅助提取、超临界CO2提取）→真空抽滤→收集滤液→测定。

（2）预处理方法。称取一定量的粉碎过筛后的墨红玫瑰花粉末，用石油醚在60℃下回流8 h进行脱脂，再用氯仿冷浸24 h处理，以除去色素、脂肪等杂质。

（3）溶剂浸提方法。按料液比1∶6加提取溶剂在恒温水浴锅中浸提一定时间，并多次提取、过滤，合并滤液，减压浓缩除去有机溶剂，采用Folin-Denis法测定玫瑰鞣质含量，然后真空冷冻干燥得到粗提物[14]。

（4）超声波辅助提取方法。精密称取脱脂后样品，加50%丙酮的水溶液。超声波提取结束后，过滤，滤液在60℃以下减压蒸去丙酮，得水溶液。采用Folin-Denis法测定玫瑰鞣质含量，然后真空冷冻干燥得到粗提物。

（5） 超临界CO2萃取方法。准确称取脱脂后的样品，装入萃取釜密闭，在夹带剂罐中装入适当夹带剂，控制超临界CO2萃取仪器的萃取温度、萃取压力、分离温度、分离压力等条件，在超临界状态下进行萃取，在一定时间后降压，从分离柱得到提取液，然后减压浓缩除去有机溶剂，采用Folin-Denis法测定鞣质含量，然后真空冷冻干燥得到粗提物[15]。

1.2.2 鞣质的定量方法

鞣质类化合物在碱性溶液中，可将磷钨酸钠还原并生成蓝色化合物，颜色的深浅与鞣质含量正相关，于波长760 nm处测比色，以鞣花酸标准品做标准曲线，再根据测得的吸光度在标准曲线上查得对应的鞣质含量。

①Folin-Denis显色剂的配制：钨酸纳50 g，磷钼酸10 g溶于含375 mL水的烧瓶中，再加入25 mL 85%的磷酸，水浴回流2 h，冷却后定容至500 mL棕色容量瓶中保存。Na2CO3饱和溶液：35 g无水Na2CO3于70℃溶解在100 mL水中，放置过夜。②标准曲线的制作：准确配制质量浓度0.102 mg/mL的鞣花酸标准溶液，分别吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL标准液加入装有25 mL水的50 mL容量瓶中，再各加2.5 mL Folin-Denis显色剂，10 mL Na2CO3饱和溶液，摇匀定容，于室温下放置30 min后比色，以平均吸光度与标准溶液的质量浓度作线性回归分析，得到回归方程。

Folin-Denis法测定鞣质含量的标准曲线见图1。

图1 Folin-Denis法测定鞣质含量的标准曲线

1.2.3 提取溶剂对鞣质回收率的测定方法

准确称取2份墨红玫瑰花瓣粉末5.00 g，其中1份中加入鞣花酸标准样约50 mg，各自按比例1∶6加入提取溶剂，浸提3次，合并滤液，定容至100 mL，另取鞣花酸约50 mg直接溶解于水并定容至100 mL，然后按上述方法进行比色测定，测出鞣花酸的含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 溶剂提取法提取墨红玫瑰花中鞣质

采用溶剂提取法提取墨红玫瑰花中鞣质，分别对提取液的选择、物料粉碎粒度、提取液的浓度、提取时间、提取温度、提取液pH值进行单因素试验。提取溶剂选择试验结果表明，丙酮溶液和乙醇溶液的提取效果均要好于水，其中60%丙酮和50%乙醇的提取率差别不大，50%乙醇经酸化后有助于鞣质的提取，并且丙酮和乙醇对鞣质的回收率相差不大，所以从提取效率和环保角度考虑，最终选用酸化的乙醇溶液进行提取。物料粉碎粒度单因素试验结果表明，随着物料粉碎粒度的增大，鞣质的提取率上升缓慢，所以选择40目为物料粉碎粒度。

2.1.1 溶剂提取法正交试验

通过单因素试验最终选择影响鞣质浸提率的因素主要有提取温度（A）、提取时间（B）、提取液浓度（C）、提取液pH值（D），设计四因素三水平的正交试验，并对试验结果进行分析，得到溶剂提取法的最优提取条件。

溶剂提取法L9（34）正交试验见表1，溶剂提取法L9（34）正交试验设计及结果见表2。

由正交试验结果分析可知，影响因素依次为提取温度＞提取液浓度＞提取液pH值＞提取时间，说明提取温度对玫瑰花鞣质的影响很大，由表7分析最优提取条件为提取温度60℃，提取时间40 min，提取液体积分数50%乙醇，提取液pH值3.0，经过验证试验验证，最终确定溶剂法提取玫瑰花鞣质的提取条件为提取温度60℃，提取时间40 min，提取液体积分数50%乙醇，提取液pH值3.0，料液比1∶6，提取率为15.473 mg/g。

表1 溶剂提取法L9（34）正交试验

表2 溶剂提取法L9（34）正交试验设计及结果

验证试验见表3。

表3 验证试验

2.1.2 提取次数的确定

在相同的提取条件下：称取2.5 g样品，用体积分数为50%乙醇酸性溶液（pH值3.0） 以1∶6的料液比，在60℃条件下每次提取40 min，共提取5次，测定每次提取液中鞣质的含量。

玫瑰花鞣质分次提取结果见图2。

图2 玫瑰花鞣质分次提取结果

从以上数据可以看出，鞣质的第1次提取率最高，约为76%，经过3次提取后，98%的鞣质可以被提出，因此，最终提取3次即可，总提取率达到20.344 mg/g。

2.2 超声波辅助提取法提取墨红玫瑰花中鞣质

称取样品（墨红玫瑰花粉末2.5 g），加60%丙酮的水溶液100 mL。选择超声时间、超声频率2个因素进行均匀设计试验，各因素取5个水平。超声提取结束后过滤，滤液60℃以下减压蒸去丙酮，得水溶液。Folin-Denis比色法测定玫瑰花鞣质提取率。

按U5（52）表安排的试验结果见表4。

表4 按U5（52）表安排的试验结果

将试验结果用计算机进行多元线性回归分析，得回归方程：Y=17.645+0.022X1+0.121X2，相关系数R=0.967，具有良好的线性关系。

方差分析结果见表5。

表5 方差分析结果

线性回归中标准偏回归系数显示，超声提取的影响效应依次为超声频率和超声时间，其中超声时间对玫瑰鞣质提取率的影响较小。依据回归方程和实际条件，选择玫瑰鞣质的最佳超声提取条件为提取时间20～30 min，超声频率为45 kHz。

按上述优化的提取条件进行玫瑰花鞣质超声波提取验证试验，共进行3次试验，得到优化条件下的玫瑰花鞣质提取率平均为23.72 mg/g，与回归方程预测值23.75 mg/g十分接近，且重复试验相对偏差不超过1，说明试验条件重现性良好。最终确定玫瑰花鞣质超声波提取的提取率可以达到23.72 mg/g。

2.3 超临界CO2萃取法提取墨红玫瑰花中鞣质

采用超临界CO2萃取法提取玫瑰花鞣质，夹带剂的选择、物料粉碎粒度、萃取温度、萃取时间、萃取压力、分离温度、夹带剂的流量、夹带剂的用量等均对提取率有一定的影响，所以初步进行单因素试验，由单因素试验结果确定夹带剂选择乙醇溶液，物料粉碎粒度40目，分离温度40℃，夹带剂流量15 mL/min，乙醇相对玫瑰粉用量在3 mL/g为适宜，并筛选出对提取率影响较显著的因素为萃取压力、萃取温度、萃取时间、乙醇体积分数，设计四因素三水平的正交试验并对试验结果进行分析，得到溶剂提取法的最优提取条件。

超临界CO2萃取法L9（34）正交试验因素与水平设计见表6，超临界CO2萃取法L9（34）正交试验设计及结果见表7。

表6 超临界CO2萃取法L9（34）正交试验因素与水平设计

表7 超临界CO2萃取法L9（34）正交试验设计及结果

由正交试验结果直观分析可知，萃取压力对玫瑰花鞣质的提取率影响最大，而萃取温度、萃取时间、夹带剂乙醇体积分数对玫瑰花鞣质的提取率影响稍小，为了确定各因素对提取效果的影响及其显著性，进行方差分析。

方差分析见表8，验证试验见表9。

表8 方差分析

表9 验证试验

由表8根据方差分析结果分析，各因素对提取率的影响大小依次为萃取压力＞萃取时间＞夹带剂体积分数＞萃取温度，最优提取条件为萃取压力30 MPa，萃取温度60℃，萃取时间60 min，夹带剂乙醇体积分数50%，经过验证试验验证，最终确定超临界CO2萃取法提取玫瑰花鞣质的提取条件为玫瑰花粉粒度40目，萃取压力30 MPa，萃取温度60℃，萃取时间60 min，分离温度40℃，分离压力8 MPa，夹带剂乙醇体积分数50%，流速15 mL/min，乙醇用量3 mL/g，超临界CO2萃取法提取玫瑰花鞣质的提取率为44.838 mg/g。

3 讨论

在玫瑰花鞣质的提取方法研究中采用了溶剂浸提法、超声波提取法和超临界CO2萃取技术3种提取方法，其中溶剂浸提法是植物中生理活性物质提取的常用方法，对试验条件要求低，经过3次浸提玫瑰花鞣质的提取率可以达到20.344 mg/g，提取时间为2 h。超声波提取法是利用超声波的振动产生强大的能量，作用于细胞组织，可加速植物中的有效成分进入溶剂，增加有效成分的提取量。超声波提取玫瑰花鞣质的提取率达到24.639 mg/g，比溶剂浸提法提高了21.1%，在30 min就可完成，比溶剂浸提法的时间缩短4倍。

超临界CO2萃取法利用超临界流体的特殊性质溶解玫瑰花中的有效成分，超临界流体对玫瑰花中的油脂等具有良好的溶解性，但对极性较强的生理活性成分溶解性较差，根据相似相溶的原理，使用夹带剂改变超临界流体的极性，使鞣质可以更多地被溶解出来。超临界CO2萃取法提取玫瑰花鞣质的提取率是44.838 mg/g，比普通溶剂法提高了1倍，比超声波提取法提高了80%，时间1 h。虽然超临界CO2萃取用的时间较超声波法长，但超临界CO2萃取提取率高，每次原料处理量大，并且CO2气体循环利用，既提高鞣质的提取率，又不会污染环境。所以最终选用超临界CO2萃取法提取玫瑰花鞣质。

4 结论

溶剂浸提法提取墨红玫瑰花中鞣质的提取工艺为萃取温度60℃，萃取时间40 min，乙醇体积分数50%，pH值3.0，料液比1∶6，提取次数3次，提取率为20.344 mg/g。

墨红玫瑰花中鞣质的优化超声波辅助提取工艺条件60%丙酮，提取时间20～30 min，超声频率45 kHz，鞣质提取率为23.72 mg/g。

超临界CO2萃取法提取墨红玫瑰花中鞣质的提取工艺为玫瑰花粉粒度40目，萃取压力30 MPa，萃取温度60℃，萃取时间60 min，分离温度40℃，分离压力8 MPa，夹带剂乙醇体积分数50%，流速15 mL/min，乙醇用量3 mL/g，超临界CO2萃取法提取玫瑰花鞣质的提取率为44.838 mg/g。