乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析

冯苏敏，贺添艳，李晓

（河南省诚建检验检测技术股份有限公司，河南郑州 450000）

0 引言

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特氏菌，广泛存在于自然界中，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[1-5]。单增李斯特氏菌食物中毒是由该菌产生的溶血素溶剂引起，易感者常为新生儿、孕妇及40岁以上人群，临床表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、抽搐、发热、昏迷、流产、败血症直至死亡[6-11]。2011年，美国由该菌造成16人死亡，是自1998年以来致死人数最多的一次食源性疾病疫情。因此，单增李斯特氏菌检验是食品卫生微生物检验重点之一。

目前，能力验证已经成为了各检测机构补充其内部质量控制技术，为自身的持续改进和质量管理提供信息的主要手段，并且近几年政府部门、社会组织及其他方在选择提供技术服务检验检测机构时，将能力验证的结果作为重要依据。重庆市食品药品检验检测研究院以GB 4789.30—2010为检验依据，对样品编号TF0580094的3个样品进行单增李斯特氏菌定性检测并取得满意结果[12]。四川省食品药品检验检测院依据《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行检测，利用BAX system Q7型全自动病原微生物检测系统对能力验证中的3个样品进行快速筛查，取得满意结果[13]。为提高实验室微生物检测能力，实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力验证计划（ACAS-PT541(2018)），按照国标方法及相关仪器对样品进行检测，试验对此次能力验证过程及结果进行分析，总结经验教训为日常的检验工作提供技术性支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

2瓶白色冻干块状的乳品样品，于2～6℃下保存，中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，代码分别为18-Y493，18-X650。

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSAYE）、李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）、PALCAM培养基、李斯特氏菌显色平板、革兰氏染色液试剂盒、单增李斯特氏菌生化鉴定套装，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

BSC-1300IIA2型生物安全柜、SW-CJ-2FD型超净工作台、BPX-272型电热恒温培养箱、BXM-75VE型立式压力灭菌器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司产品。

1.2 标准菌株

（1） 阳性对照菌株。单核细胞增生李斯特氏菌，菌株编号：BNCC314197（ATCC19115等效菌株），购于北京北纳创联生物技术研究院。

（2）阴性对照菌株。英诺克李斯特氏菌，菌株编号：BNCC186087（ATCC33090等效菌株），购于北京北纳创联生物技术研究院。

以上菌株传代次数均未超过5代。

1.3 试验方法[14-15]

1.3.1 样品处理

样品需要用40.0 mL无菌再水化。无菌开启样品后，立即加入4 mL无菌水进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即为待测样品原液。

1.3.2 增菌

以无菌操作吸取取25 mL样品原液转至含有225 mL LB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1～2 min，于30±1℃下培养24±2 h，移取0.1 mL，转种于10 mL LB2增菌液内，于30±1℃下培养24±2 h。

单增李斯特氏菌常见的增菌方法有LB二次增菌法，EB法、改良FDA法及Fraser肉汤增菌法，通过4种方法对同一样品进行增菌，采用PALCAM选择性平板进行分离，再进行国标生化鉴定，对比4种增菌方法对样品的检出率，LB二次增菌法是4种方法中检出率较高且较为稳定的增菌方法，因此选择LB二次增菌法。

1.3.3 分离

取LB2增菌液一环划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板，于36±1℃下培养24～48 h，观察各个平板上菌落生长情况。李斯特氏菌显色平板中所含色素与单增李斯特氏菌具有的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在平板上，单增李斯特氏菌呈现蓝绿色的光滑规则的小菌落，抑制剂和配套试剂可抑制杂菌的生长。另外李斯特氏菌常见分离平板还有PALCAM，OXA，OXA和LPM，对4种选择性分离培养基上目标菌的生长率和非目标菌的抑制性进行比较，结果显示目标菌在LMP上的生长率最低，其余3种分离培养基的生长率差异不大；综合比较对非目标菌的抑制性，PALCAM最佳；然而检测杂菌较多的样品时，PALCAM的选择性灵敏度最高[16]。

1.3.4 初筛

自选择性平板上分别挑取5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36±1℃下培养24±2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于36±1℃下培养18～24 h，选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

1.3.5 鉴定

根据初筛结果，对1.3.4的纯培养物进行革兰氏染色镜检、动力试验、溶血试验过氧化氢酶试验及生化鉴定，生化鉴定按生化试剂盒操作说明进行。

单增李斯特氏菌微量生化试验见表1。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

样品18-X650在PALCAM琼脂平板为黄白色菌落，在李斯特氏显色平板为黄白色菌落。样品18-X650在PALCAM平板和李斯特氏显色平板上均无典型或可疑菌落。样品18-Y493在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈；在李斯特氏显色平板上为蓝绿色菌落，周围有不同透明晕圈。初步可判断样品18-X650为非单核细胞增生李斯特氏菌，样品18-Y493为可疑单核细胞增生李斯特氏菌。

2.2 鉴定结果

对样品18-Y493的纯培养物进行革兰氏染色镜检、动力试验、溶血试验及生化鉴定。结果显示，样品18-Y493为革兰氏阳性短杆菌，在半固体上呈伞状生长，在血平板上为宽大、轮廓清晰、完全透明的溶血圈；阳性菌株为革兰氏阳性短杆菌，在半固体上呈伞状生长，在血平板上为狭窄、清晰、明亮的溶血圈。

生化试验反应结果见表2。

表2 生化试验反应结果

通过与阳性菌株的系列反应结果相比较，可判断样品18-Y493为非单核细胞增生李斯特氏菌。

此次结果报告为样品18-X650未检出单核细胞增生李斯特氏菌25 mL，样品18-Y493未检出单核细胞增生李斯特氏菌25 mL。中国检验检疫科学研究院测试评价中心判定实验室检测结果与指定值一致，结果评价为满意。

3 结论

食品微生物检测中，检测杂菌较多的样品时，常使用2种及2种以上分离平板对目标菌进行分离筛选，以防漏检。国标GB 4789.30—2016中单增李斯特氏菌选用李斯特氏菌显色平板和PALCAM平板，李斯特氏显色平板的选择特异性较强，由于防止其对其他菌进行抑制的同时干扰到目标菌，使目标菌生长缓慢或抑制其生长，而PALCAM平板可以扩大目标菌的检测范围，因此需要2种平板配合使用，提高目标菌的检出率。单增李氏特菌检验中在TSA-YE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和李斯特氏菌显色平板上分离菌落时可能黏有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是1个样品中可能分离到1种以上的李斯特氏菌。

此外，依据样品18-Y493的生化鉴定反应结果，可判断样品18-Y493为非单核细胞增生李斯特氏菌，疑似斯氏李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌，由于实验室条件限制，未能判定其菌株类型。此次实验室按照CNAS RL02：2011《能力验证规则》等CNAS政策要求参加微生物项能力验证，并取得满意结果。此次结果可作为证明实验室技术能力的有效证明，为监管部门、客户和其他利益相关方选择、评价、认可实验室提供参考依据。参加能力验证是实验室质量控制的重要手段，为不断提升自身检验检测能力，发现和解决检测过程中所遇到的问题，实验室将持续性参加能力验证项目。