端粒酶在宫颈癌诊断和治疗中的研究进展

王丽丽，杨宇琴，黎 晨，尤培蒙，杨 田，赵 晋

(西北民族大学 医学院，甘肃 兰州 730030)

宫颈癌是最常见的妇科肿瘤之一，是目前全球女性癌症相关死亡的第四大主要病因，并已经成为发展中国家第二大常见癌症[1].高危型HPV感染是宫颈癌发生发展的必要条件，可影响细胞的周期、凋亡以及DNA损伤反应等，其中E6和E7癌蛋白的表达至关重要[2].端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由人端粒酶RNA组分(human telomericRNA component，hTERC)、人端粒酶逆转录酶(human telomeric reverse transcriptase，hTERT)及人端粒酶相关蛋白(human telomeric associated protein，hTP) 3部分亚基构成.除少数正常组织如生殖细胞等有端粒酶活性，大部分正常组织中端粒酶活性被抑制，而在肿瘤细胞中端粒酶激活，导致细胞出现无限增殖，发生恶变[3].同样，端粒酶激活与宫颈癌发生机制有密切关系[4]，在宫颈癌的诊疗中有很大的应用前景.本文对端粒酶在宫颈癌诊断和治疗中的研究进展进行综述.

1 端粒酶的结构及功能

端粒酶是一种以内源RNA为模板的核糖核蛋白酶，其识别并结合在富含G的端粒末端，然后逆转录合成新的TTAGGG重复序列，以维持端粒长度的稳定.一般认为，人类端粒酶由三部分组成，即人端粒酶逆转录酶(human telomeric reverse transcriptase，hTERT)、作为模板的人端粒酶RNA组分(human telomeric RNA component，hTERC)和一些端粒酶相关蛋白(human telomeric associated protein，hTP).人正常组织细胞内hTERT基因位于五号染色体短臂15.33位置，长约40 kb，其编码的hTERT是端粒酶活性的必需和限速决定因子，hTERT扩增、hTERT结构变异、hTERT启动子突变和通过hTERT启动子甲基化进行表观遗传修饰，会使hTERT表达上调[5]，与细胞恶变有关.hTERT蛋白具有7个蛋白质域和端粒酶催化亚基独特的T框架保守区域以及非活性结构域DAT，是主要分布在细胞核中的逆转录酶[6].hTERC基因定位于3号染色体长臂26.3位置，长约450 bp，无内含子，为端粒合成提供模板.其编码的蛋白对维持端粒长度、调节端粒酶活性有重要作用.该基因扩增可阻止细胞凋亡，导致细胞的永生化和肿瘤的发生[7].hTP包括p23、hsp90、hsp40等，能特异地结合hTERC而形成模板-引物的结合位点，在各组织中hTPmRNA的表达水平差异与端粒酶的活性无关，可能有介导端粒酶或其他端粒结合蛋白与端粒结合的功能，从而调节端粒酶活性[6，8].

2 端粒酶与宫颈癌诊断

在许多正常的体细胞中端粒酶检测为阴性，但在包括宫颈癌在内的人类85%～95%的肿瘤细胞中可检测到端粒酶的表达[9-10]，因此端粒酶可作为宫颈癌诊断的标志物.目前可采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定法 (TRAP-ELISA)来检测宫颈癌中异常升高的端粒酶活性[11].近年来，端粒酶组成成分hTERT和hTERC的检测成为宫颈癌诊断的热点.

2.1 hTERT检测

在正常组织中几乎无hTERT的表达，而在大部分恶性肿瘤细胞中则能检测出hTERT的表达，并且发现肿瘤的恶性程度和转移能力与hTERT活性有关，说明良、恶性组织中hTERT的表达存在着明显差异[12]，这为hTERT检测作为恶性肿瘤的诊断方法提供了依据.Branca等[13]指出，hTERT上调与宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN)的分级有关.随着进行性CIN线性增加，在癌症中最强烈，表明在筛查宫颈癌前病变方面hTERT是有重要意义的潜在标志物，但他们发现hTERT不是宫颈癌高危人乳头瘤病毒，病毒持续性或疾病预后的独立预测因子.将hTERT检测(高特异性和高阳性预测值)与另一种显示高敏感性和高阴性预测值的检测相结合，才能作为一种能够高效检测CIN病变的理想筛查工具.此外，最近的研究[14-16]表明，hTERT基因的甲基化检测可能是早期检测宫颈癌的一个重要的生物标志物，并且因为hTERT基因甲基化模式可能取决于HPV类型，所以评估hTERT甲基化联合HPV种类或HPV特异性类型的应用，有助于提高宫颈鳞状上皮内病变的检测.

2.2 hTERC检测

研究[17-18]表明，宫颈病变的发展与hTERC基因的异常扩增有关，且扩增水平随着宫颈病变分级的增加而上升，这与hTERC激活癌基因表达以及促进侵袭分子产生的作用有关，因此hTERC基因检测可作为一种宫颈癌早期诊断的有效方法.相比常用的液基细胞学检查和HPV检测，应用荧光原位杂交(FISH)技术检测hTERC基因，不仅特异度与准确度较好，还具有定位准确、结果客观清晰等优点，对高级别的CIN检测灵敏性更高，能够提高高位病变的检出概率[19].陈露露等[20]利用FISH技术检测宫颈疾病中hTERC基因的表达情况，也发现随宫颈病变级别的升高hTERC基因的表达水平增加的现象.同样证明了宫颈脱落细胞中hTERC基因的检测对宫颈病变的发展趋势具有一定的预测价值.虽然hTERC基因的单独检测对宫颈癌诊断有一定的价值，但是联合其他标志物的检测更有意义.陈光治等[21]发现，FOXM1、hTERC与C-myc结合检测有可能作为HPV阳性宫颈癌的筛查及预后评估的标志物.FISH技术联合免疫组化技术同时能检测hTERC基因与hTERT蛋白，有助于诊断难以判断CIN级别的病例，可用于宫颈癌前病变的早期筛查[4].

3 端粒酶与宫颈癌治疗

虽然手术、化疗和放疗可以治愈90%以上的早期宫颈癌，但复发和转移仍然是宫颈癌患者死亡的主要原因，人类在开发基因疗法和设计治疗宫颈癌的新药方面已作了大量的努力[22].目前，从端粒酶方向研究宫颈癌治疗的方法主要有靶向沉默hTERT基因的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术和端粒酶抑制剂的研发.

3.1 靶向沉默hTERT基因的RNAi技术

基因治疗被认为是治疗各种疾病的一种新方法.在过去几年中，分子生物学和基因组学迅速发展，针对分子靶点的宫颈癌基因治疗有许多突破性进展，基因治疗被认为是一种治疗宫颈癌的新方法[23].在反义核苷酸技术、RNAi技术和核酶技术三种肿瘤基因治疗中，RNAi技术利用siRNA ( short interference RNA，siRNA)在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭，并有着结构稳定和比用核酶或反义RNA更有效、更彻底的优点，成为一种全新的潜力巨大的基因治疗手段[24].

王彦等[25]研究发现，siRNA靶向沉默宫颈癌Caski细胞的hTERT基因后，能抑制该种癌细胞的增殖和迁移能力，提示hTERT基因可在宫颈癌的基因治疗中提供新的靶点.Shi等[26]发现，siRNA抑制hTERT表达可抑制宫颈癌细胞的体外和体内生长.hTERT的减少在一定程度上通过PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤的生长，同样为hTERT基因作为抗癌基因治疗靶点提供了依据.比起在体内直接递送siRNA，通过病毒载体对siRNA进行感染性递送更加具有高稳定性[27].赵红珂等[10]指出，以慢病毒介导的利用siRNA沉默hTERT感染宫颈癌Caski细胞，能高效特异地下调目的基因hTERT的表达，促进细胞的凋亡，能够有效抑制宫颈癌Caski细胞的生长和增殖.

3.2 端粒酶抑制剂

与大部分正常细胞不同，癌变细胞内端粒酶被重新激活，导致细胞永生化，而拥有高度激活端粒酶的癌细胞还对包括各种放化疗在内抗癌治疗产生抗性，因此抑制端粒酶活性或降低其蛋白水平，一方面能抑制癌细胞生长和促进癌细胞凋亡，另一方面能增加癌细胞对放化疗的敏感，这也是研发端粒酶抑制剂的背景[28].目前研究较多的为hTERT抑制剂，包括BIBR1532和3-叠氮脱氧胸苷(AZT).研究[29-30]表明，BIBR1532和AZT可抑制HeLa细胞的生长或提高HeLa细胞的放化疗敏感性.小分子化合物BIBR1532可与hTERT亚单位FVYL序列结合，阻断端粒酶与RNA模板TER活化结构域的结合，导致端粒酶催化端粒DNA合成与延长受到干扰，是一种选择性端粒酶活性抑制剂[31].AZT能够不可逆转地缩短HeLa细胞的端粒，还可以在体外增强紫杉醇对宫颈癌HeLa细胞的化疗敏感性.该作用与抑制逆转录酶活性、降低肿瘤细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达有关[32-33].

4 小结

宫颈癌的发生一般需要几年至十几年的时间，因此宫颈病变的早期发现和诊断意义重大，而对宫颈癌治疗方法的探索也是当今的重点.越来越多的研究表明，端粒酶作为早期诊断宫颈癌的生物学指标有一定价值，其中包括对hTERT和hTERC的检测.同时，端粒酶激活是细胞永生化的必需条件，以端粒酶作为宫颈癌的治疗靶点表现出许多优势，其中就包括靶向沉默hTERT基因的RNAi技术和端粒酶抑制剂的应用.相信随着对端粒酶与宫颈癌关系研究的深入，端粒酶在宫颈癌的诊治方面会有更大的利用价值.