关宝生 张睿迪 白雪 王景涛 尹相林 王嘉淇 曹刘芳 王健宇 刘良辰 邱洪斌
(1佳木斯大学公共卫生学院,黑龙江 佳木斯 154007;2黑龙江省痛风研究重点实验室;3佳木斯大学基础医学院)
高尿酸血症(HUA)是由于体内嘌呤代谢异常,导致血尿酸(SUA)生成过多和(或)排泄障碍而引起的一种代谢性疾病。中国大陆地区31个省、市、自治区成人的HUA患病率由1985年的15%左右上升至2017年的20%左右〔1〕。尿酸(UA)是人体重要的代谢产物,正常生理水平的UA是一种天然的抗氧化剂,具有多重抗氧化能力,能够清除氧自由基和活性氧〔2,3〕。然而,当机体UA水平持续升高,则会影响机体氧化-还原系统的平衡,表现出明显的促氧化作用,能够促进自由基链式反应的其他自由基产生,诱发机体氧化应激,从而损伤细胞,并与高血脂、糖尿病、冠心病和脑卒中等众多疾病的发生、发展关系密切〔4〕。Xue等〔5〕随机抽取58例轻度认知功能障碍(MCI)患者和57例健康老年人进行微型精神状态检查,并观测其体内SUA水平与MCI发生发展的关系;其研究结果显示,MCI组UA水平显著低于正常对照组,提示低水平SUA是MCI的危险因素,适当增加SUA水平可延缓MCI的发生和发展。果蝇是一种重要的模型生物,在神经生物学研究方面具有重要的作用。本研究通过高嘌呤饮食构建果蝇HUA模型,探讨UA对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响及其机制。
1.1果蝇品系及饲养条件 选用W1118野生型黑腹果蝇,为佳木斯大学尿酸功能研究团队自有。果蝇均饲养在恒温恒湿培养箱中,培养温度设为(25±0.5)℃,湿度设为(40±0.5)%、光照周期为12 h。果蝇饲养使用标准玉米粉培养基。
1.2实验试剂 腺嘌呤购于北京索莱宝生物科技有限公司;酵母购于英联马利(英国联合食品集团);逆转录试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3实验仪器 果蝇嗅觉行为测试设备购自苏州卓凯生物技术有限公司;聚合酶链反应(PCR)仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。
1.4实验分组 根据前期预实验,共设3个组别,对照组(标准玉米粉培养基)、低浓度干预组(腺嘌呤浓度为0.1%的培养基)、高浓度干预组(腺嘌呤浓度为0.3%的培养基)。收集羽化后的果蝇10 200只,每组3 400只果蝇,雌雄各半。
1.5果蝇体内UA水平的测定 每组取25只果蝇并称重,按重量(g)∶蒸馏水(ml)=1∶9的比例,用玻璃匀浆器制成组织匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清液,采用ELISA检测果蝇体内UA水平。
1.6果蝇嗅觉学习记忆能力相关指标的检测
1.6.1嗅觉学习记忆能力测试所需气味的制备 0.15% 3-辛醇(OCT):按照每100 ml石蜡油中溶解150 μl OCT配置。0.10% 4-甲基环己烷(MCH):按照每100 ml石蜡油中溶解100 μl MCH配置。
1.6.2嗅觉学习记忆能力的测定 每次取100只果蝇进行嗅觉行为测试,在温度(25±0.5)℃、湿度(70±0.5)%、620 nm红光灯暗房的条件下,将上述两种气味接入自动嗅觉行为测试设备,其中一种气味伴随电击,对果蝇嗅觉行为进行干预后将果蝇放入T-Maze中间的空腔中,左右两侧接入相同气体,观察果蝇趋避有害因素的行为,随后记录选择两种气味的果蝇数量。重复上述测试,更换另一种气味伴随电击,并做好记录。分别对雌雄性果蝇进行测定,每个性别果蝇进行8次行为测试,结果取平均值。最后计算果蝇行为反应指数(PI),指数为0表示没有学习记忆能力,指数为正则表示有学习记忆能力,指数为负则表示结果无效。PI=(PIOCT+PIMCH)/2×100;PIOCT=(XMCH-XOCT)/X总;PIMCH=(XOCT-XMCH)/X总。X代表选择每种气味的果蝇数。
1.6.3应用逆转录(RT)-PCR检测嗅觉相关基因mRNA的表达 取培养7 d的果蝇,每组雌雄各20只,应用Trizol法提取RNA,以RT-PCR法测定果蝇体内Rugose(Rg)、锌指蛋白轮状体(Rn)和Tau嗅觉相关基因mRNA的表达水平,以β-actin为内参基因,结果以目的基因的光密度/内参基因的光密度表示,引物为正义:TGCTGCTCCACCATGCCATTAAG,反义:CTCCAGTTCCTCCACCTCTTCCT;Rn正义:GCCTTCGCCAACTCGTCGTATC,反义:TGTGCTTGGTCAGGTAGGTCTCC;Tau正义:ACAATGACAGCGGCGTGGATG,反义:GGTCTTGAGGAGCAAGCGGTTC;β-actin正义:GCATCCACGAGACCACCTACAAC,反义:AGCCACCGATCCAGACAGAGTAC。
1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。
2.1果蝇体内UA水平 随着培养基中腺嘌呤浓度的升高,与对照组比较,各干预组果蝇体内UA水平显著升高(P<0.01)。各干预组组内雌雄性果蝇体内UA水平也存在明显差异,低浓度干预组雄性果蝇体内UA水平显著高于雌性果蝇,但在高浓度干预组雌性果蝇体内UA水平显著高于雄性果蝇(P<0.01)。见表1。
表1 各组果蝇体内UA水平
与对照组比较:1)P<0.01,与雌性果蝇比较:2)P<0.01
2.2UA对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响 随着果蝇体内UA水平的升高,与对照组比较,低浓度干预组雄性果蝇的嗅觉学习记忆能力明显升高(P<0.05);高浓度干预组雄性果蝇的嗅觉学习记忆能力较低浓度干预组略降低。雌性果蝇随着体内UA水平的升高其嗅觉学习记忆能力出现明显的降低趋势,但与对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 各组果蝇嗅觉学习记忆能力的变化
与对照组比较:1)P<0.05
2.3各组果蝇嗅觉相关基因的表达 与对照组比较,雄性果蝇低浓度干预组Rg、Rn基因的表达量有增高的趋势,但差异不具有统计学意义,高浓度干预组Rg、Rn基因的表达量显著升高(P<0.05);与对照组比较,雄性果蝇低浓度干预组Tau基因的表达量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01),高浓度干预组Tau基因的表达量却显著降低(P<0.05)。与对照组比较,雌性果蝇低浓度干预组Rg基因的表达量显著升高(P<0.05),而高浓度干预组Rg基因的表达量显著降低(P<0.01)。与对照组比较,雌性果蝇低浓度干预组Rn基因的表达量有增高的趋势,但差异不具有统计学意义,而高浓度干预组Rn表达量显著降低(P<0.05)。与对照组比较,雌性果蝇低浓度与高浓度干预组雌性果蝇Tau基因的表达变化不明显(P>0.05)。见表3,图1。
表3 各组果蝇Rg、Rn和Tau基因mRNA的表达
与对照组比较:1)P<0.05,2)P<0.01
1 对照组(雌),2 低浓度干预组(雌),3 高浓度干预组(雌),4 对照组(雄),5 低浓度干预组(雄),6 高浓度干预组(雄)图1 各组Rg、Rn、Tau基因mRNA表达
本研究结果证明果蝇HUA模型建立成功。低浓度干预组雌性果蝇体内的UA水平显著低于雄性果蝇组,提示雌激素可能抑制了UA的生成和(或)促进其排泄;而高浓度干预组雌性果蝇体内的UA水平则显著高于雄性果蝇组,提示雌激素的作用可能被抑制。
本研究显示,提高雄性果蝇体内UA水平可明显促进其嗅觉学习记忆能力,但随着UA水平的进一步升高,则表现出一定的抑制作用。然而,雌性果蝇呈现完全不一样的结果,UA不仅不能提高雌性果蝇的嗅觉学习记忆能力,还表现出一定的抑制作用,推测可能与其体内雌激素对UA代谢的影响有关。以上研究结果提示UA可能通过调控果蝇体内嗅觉学习记忆相关基因的表达,从而影响其嗅觉学习记忆能力。
Tau基因是一种果蝇的微管相关蛋白,主要存在于中枢神经系统神经元轴突中〔6〕。研究发现Tau蛋白激酶与磷酸酯酶功能失衡,引起Tau蛋白磷酸化的异常升高,打破其与微管结合的动态平衡,使Tau蛋白发生异常聚集、纤维化和神经纤维缠结,导致神经元轴突转运障碍,并抑制乙酰胆碱释放及蛋白酶体的活性,导致神经元呈慢性进行性变性〔7~13〕。同时,有研究发现阿尔茨海默病与神经元细胞中Tau的异常磷酸化和表皮生长因子受体(EGFR)信号相关〔14,15〕。果蝇中Rg是哺乳动物和人神经信号蛋白(NBEA)的同源物,是一种与突触处的神经递质/内膜囊泡运输有关的支架蛋白。有研究显示,携带Rg突变体的果蝇表现出与人NBEA缺失所致自闭症相似的学习缺陷和认知障碍,并与EGFR和delta-notch通路的基因存在相互作用〔16~19〕。Rn在果蝇嗅感受器神经元前体中表达,对其嗅觉系统发育的控制起至关重要的作用〔20〕。
本研究发现,UA对雌性果蝇和雄性果蝇Rg、Rn和Tau基因mRNA的表达变化存在不同的影响,在雄性果蝇中,Rg和Rn基因mRNA的表达量随着UA水平的升高而升高,而Tau基因mRNA的表达量却呈现先升高后降低的趋势。然而,在雌性果蝇中,Rg和Rn基因mRNA的表达量随着UA水平的升高呈现先升高后降低的趋势,Tau基因mRNA的表达量几无变化。本研究发现,UA可能不是通过调控果蝇体内Rg和Rn基因表达而影响其嗅觉学习记忆能力,或者也可能是因为雌激素的存在掩盖了UA对雌性果蝇嗅觉学习记忆能力的影响。然而Tau基因的表达变化与果蝇嗅觉学习记忆能力的变化趋势基本一致,提示Tau在UA对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响方面可能扮演着重要的角色。因此,下一步拟通过果蝇HUA模型进一步探讨UA对Tau基因的调控作用,揭示其机制,并验证雌激素对UA代谢的影响。