杏RPW8基因家族鉴定与表达量分析

许靖诗，王广军，额尔敦达来，乌云塔娜

（1.北海市林业技术推广站（林木种苗管理站）广西 北海 536000；2.广西北海滨海国家湿地公园管理处， 广西 北海 536000；3.内蒙古自治区赤峰市巴林右旗巴彦塔拉苏木政府林业站，内蒙古 赤峰 024000； 4.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，国家林业局泡桐研究开发中心，经济林种质创新与利用 国家林业局重点实验室，河南 郑州 450003）

杏Armeniaca vulgaris属于蔷薇科Rosaceae 李亚科Prunoideae 杏属Armeniaca 植物[1]。果肉不仅风味甜美，且营养价值极高[2-4]。其果肉、果仁、核壳被广泛应用，是食品、药品、化妆品、工业等行业的重要原料[5-8]。然而，近年随着气候的变化，白粉病也成为杏的重要病害，严重影响其产量及果实品质。

白粉病（Powdery mildew）为寄生型真菌病害，是由真菌中的白粉菌Erysiphaceae 引起的，在自然界较为常见[9]。白粉菌属于子囊菌纲，菌丝体直接暴露于寄主植物的芽、叶、茎、花蕾、花及果实的表面，并产生由菌丝体、分生孢子和分生孢子梗聚集成的白色粉状物，因而称为白粉病[10]。感染白粉病的作物的产量会降低，品质也会受到严重影响[11-12]。白粉病对葡萄[13]、草莓[14]、芒果[15]等果品造成严重影响。我国已报道的白粉菌属种类已多达约500种，危害约10 000种不同植物物种[16]。

RPW8是一个广谱抗病基因，在拟南芥中含有两个紧密连锁的基因RPW8.1和RPW8.2[10]。研究发现RPW8基因不仅能对拟南芥白粉病产生抗性，同时还对拟南芥霜霉病、烟草白粉病和烟草花叶病等多种植物病害表现出较高的抗性[17-19]。为了更深入了解并应用RPW8基因在不同植物中的功能，前人也进行了较多研究。余力[20]将拟南芥广谱坑病基因RPW8.1导入甘蓝型油菜，证明RPW8.1基因对霜霉菌在油菜组织细胞中的生长产生了明显的抑制作用。而兰宇[21]将RPW8.1基因转入马铃薯栽培种“大西洋”中，发现不能产生相应抗性。孙金巧[22]发现甘蓝型油菜中RPW8同源基因具有类似于拟南芥中RPW8基因的部分功能，有部分基因具有抗白粉菌的功能。侯凤娟[23]对RPW8.2转基因葡萄进行了生物学特性观察及白粉病抗性评价，研究发现自然感病情况下转基因葡萄对白粉菌抗性强于野生型植株。马辉[24]利用同源克隆技术从葡萄中克隆得到了RPW8.2的同源基因，发现同不同葡萄组织中均有表达但是表达丰度不尽相同。除RPW8基因功能研究之外，Xiao、Eckardt 等[25-27]对作用机制进行了一定研究。随着研究的不断深入，植物RPW8基因的功能及抗病机理被逐渐认识，但该家族基因在杏中研究却鲜见报道。本文以杏全基因组数据为基础，鉴定RPW8家族成员，分析核酸序列的特征、蛋白质理化性质，预测基因结构、蛋白保守结构域、家族系统进化关系等信息，明确杏RPW8家族基因在不同组织中的表达特征，有利于更加深入了解RPW8基因家族功能，同时也为杏抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

杏的不同组织器官样品采摘自河北省张家口、内蒙古赤峰杏资源圃，品种为龙王帽。取样完成后，液氮速冻，-80℃保存。

1.2 RPW8 基因家族成员鉴定

杏树基因组、蛋白序列和CDS 序列由中国林业科学研究院经济林研究开发中心提供，上述数据主要通过DNA 提取、PacBio 建库测序、从头组装及注释获得，数据尚未公布。梨树Pyrus pyrifolia、桃树Prunus persica蛋白序列下载自蔷薇科基因组在线数据资源GDR（GENOME DATABASE FOR ROSACEAE，https://www.rosaceae.org/）。拟南介Arabidopsis thaliana、杨树Populus L.的基因组蛋白质序列从美国国立生物技术信息中心（NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站下载。RPW8基因家族的隐马尔科夫模型PF05659 下载于pfam 数据库（http://pfam.xfam.org/），使用hmmsearch（版本号：3.1b2）程序比对到下载好的蛋白序列，设置参数--cut_ga，通过TBtool 提取目标序列。

1.3 杏RPW8 基因家族的生物信息学分析

利用在线分析软件SMS（Sequence manipulation suite，http://www.bioinformatics.org/sms2/dna_stats.html）对RPW8基因家族16 个基因的核酸特征进行分析；利用在线软件ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析RPW8基因家族氨基酸的理化性质；通过GSDS2.0 在线软件（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）对RPW8基 因 家 族16 条 基因的基因结构进行分析；利用MEME 在线软件（http://meme-suite.org/tools/meme）对杏RPW8 蛋白motif 进行预测分析，设置motif 数量为10；利用MAGA6.0 构建杏、梨、桃子、拟南介、杨树RPW8基因家族的系统进化树。首先利用Align 进行序列对比，再使用Phylogeny 中的邻接法（Neighbor-Joining）构建进化树，校验参数 BootStrap 重复为1 000 次，其他参数均为默认值；通过软件TBtool 对杏RPW8基因家族的16 条基因在不同组织中的表达量进行分析

1.4 杏RPW8 基因家族表达量的计算

杏不同组织转录组数据主要通过RNA 提取、Illumina 建库测序，测序读长为双末端150 bp。原始数据经过滤后与参考基因组进行比对，通过FPKM法计算出每个基因在不同组织中的表达量，数据由中国林业科学研究院经济林研究开发中心提供，且尚未公布。

2 结果与分析

2.1 杏RPW8 基因家族的核酸序列的基本分析

从杏基因组数据库中共鉴定到16 个RPW8家族基因，命名为LWMRPW8-1—LWMRPW8-16。利用SMS 对RPW8基因的核苷酸序列进行在线分析，结果显示16 个基因的序列长度差异较大，其中LWMRPW8-2、LWMRPW8-4、LWMRPW8-6、LWMRPW8-9、LWMRPW8-10、LWMRPW8-12、LWMRPW8-15的序列较长，全长为3 131—7 429 bp，而LWMRPW8-3、LWMRPW8-8、LWMRPW8-11、LWMRPW8-13、LWMRPW8-16的序列较短，全长为360～894 bp。碱基对的比例之间相差较小，其中基因LWMRPW8-6的碱基G+C 含量最低为37.39%，而碱基A+T 的含量最高为62.61%。基因LWMRPW8-11的碱基G+C 含量最高为46.89%，而碱基A+T 的含量最低为53.11%。

表1 基因家族的核酸分析Table1 A comparison nucleic acid sequences of RPW8 gene family

2.2 杏RPW8 基因家族编码的氨基酸

对RPW8基因家族编码的氨基酸的理化性质进行分析（表2），结果表明相对分子量最小的是LWMRPW8-10，为13 653.93 Da，相对分子量最大的是LWMRPW8-15，为92 617.92 Da；理论 等 电 点 范 围 为5.42～9.47；LWMRPW8-9带的负电荷氨基酸数量最高为113，LWMRPW8-13和LWMRPW8-16带的负电荷氨基酸数量最低均为17，LWMRPW8-4带的正电荷氨基酸数量最高为109，LWMRPW8-10带的正电荷氨基酸数量最低为18 个；蛋白质不稳定性指数范围为22.94～61.18，其中LWMRPW8-16的不稳定性指数最低，而LWMRPW8-10的不稳定性指数最高；脂类结合蛋白质指数介于85.21～124.08 之间，其中LWMRPW8-13的脂类结合蛋白质指数最低，LWMRPW8-8的脂类结合蛋白质指数最高。RPW8基因家族编码的氨基酸组成成分以亮氨酸（Leu）赖氨酸（Lys）为主。

表2 RPW8 基因家族氨基酸序列的组成成分及理化性质分析Table2 A comparison of composition,physical and chemical characters of amino acid sequence of RPW8 gene family

2.3 杏RPW8 基因结构分析

通过GSDS2.0 在线分析，结果表明杏RPW8家族基因结构内含子数量小于6 个，外显子为1～7 个（图1）。基因LWMRPW8-16含有1 个内 含 子；基 因LWMRPW8-1、LWMRPW8-2含 有2 个内含子；基因LWMRPW8-12含有3 个内含子；有4 个 基 因（LWMRPW8-4、LWMRPW8-7、LWMRPW8-9、LWMRPW8-15） 含 有4 个 内 含子，基因LWMRPW8-6所含内含子最多，为6个；有7 个 基 因（LWMRPW8-3、LWMRPW8-5、

LWMRPW8-8、LWMRPW8-10、LWMRPW8-11、LWMRPW8-13、LWMRPW8-14）无内含子，仅含有1 个外显子数。LWMRPW8-16含有2 个外显子；LWMRPW8-1和LWMRPW8-2含 有3 个 外 显 子；LWMRPW8-7、LWMRPW8-9、LWMRPW8-12含有4个外显子；LWMRPW8-4、LWMRPW8-15含有5 个外显子；LWMRPW8-6的外显数含量最多，为7 个。

2.4 杏RPW8 保守结构域蛋白分析

利用MEME 在线工具对杏RPW8 保守结构域蛋白分析，由图2可知，RPW8 蛋白共找到10 个保守基序。Motif9（E-value 为1.3e-064）在16 条基因中均存在，而Motif 4（E-value 为2.0e-055）仅在5 条基因中出现。Motif 1（E-value 为7.0e-103）、Motif 3（E-value 为1.4e-064）、Motif 5（E-value 为6.0e-080）在6 条基因中出现。Motif 2（E-value 为3.1e-091）在9 条基因中存在，Motif10（E-value 为5.6e-042）出现在11 个基因中出现，Motif 7（E-value为9.1e-055）在13 条基因中出现，Motif 8（E-value为2.3e-129）在14 个基因中出现。

2.5 RPW8 家族系统进化关系分析

图1 山杏RPW8 基因结构图Fig.1 Structure of RPW8 gene in Apricot

利用MAGA6.0 构建杏、梨、桃、拟南介、杨树RPW8基因家族的系统进化树可知，RPW8基因家族可以分为两类，蔷薇科的杏、梨、桃RPW8家族基因聚为一类，拟南芥和杨树RPW8家族基因聚为一类（图3）。杏16 个RPW8基因之间遗传距离为2～23，LWMRPW8-5与LWMRPW8-11之间遗传距离最近，LWMRPW8-7与LWMRPW8-11之间遗传距离最远。LWMRPW8-7与杏中其他家族成员及桃、梨RPW8家族成员遗传距离较远，而与杨树、拟南芥RPW8基因较近，因而聚为一类。经多序列对比发现LWMRPW8-7与杏RPW8基因家族其余成员的同源性较低为20%～47%，亲缘关系较远。LWMRPW8-7与其中6 条基因同源性为20%～29%，与其中8 条基因同源性为30%～39%，与其中1 条基因同源性为47%。

2.6 杏RPW8 基因在不同组织中的表达分析

通过对杏RPW8基因在不同组织中的表达分析结果显示，16 个基因在花、花芽、叶片、果肉、果仁中的表达呈现较大差异，在相同组织中不同基因表达量不一样，在不同组织中同一基因表达量也不同（图4）。4 个基因（LWMRPW8-9、LWMRPW8-4、LWMRPW8-10、LWMRPW8-12）在不同器官中表达量较高，其中LWMRPW8-9在叶片中表达量最高，达到27.28FPKM。而LWMRPW8-11、LWMRPW8-7、LWMRPW8-6、LWMRPW8-2、LWMRPW8-1、LWMRPW8-15仅在花芽中有一定表达，而在花、叶片、果仁、果肉中表达量较低，甚至不表达。LWMRPW8-8、LWMRPW8-5、LWMRPW8-3、LWMRPW8-16、LWMRPW8-13、LWMRPW8-14在各个器官中不表达。以上结果表明杏RPW8基因具有较高的组织表达特征，部分同源基因功能可能发生分化。

3 结论与讨论

本研究基于杏基因组，鉴定出杏的16 个RPW8家族成员，基因全长为360～4 864 bp，杏RPW8基因家族编码的氨基酸分子量为13 653.93～92 617.92 Da，理论等电点为5.42～9.47，不稳定性指数为22.94～61.18，氨基酸组成成分以亮氨酸、赖氨酸为主。杏RPW8基因结构分析预测杏内含子数量小于6 个，外显子为1～7 个。保守结构域预测发现杏RPW8家族主要含有10 个Motify，其中Motif8、Motif9 为特征结构域；杏、梨、桃、拟南介、杨树RPW8基因家族的系统进化关系可以分为两类，蔷薇科植物RPW8家族基因聚为一类，LWMRPW8-7与拟南芥、杨树基因聚为一类。

图2 RPW8 蛋白质保守基序分布Fig.2 Distribution of conserved motifs in RPW8 Proteins

续图2 RPW8 蛋白质保守基序分布Continuation of fig.2 Distribution of conserved motifs in RPW8 proteins

图3 杏、梨、桃、拟南芥、杨树RPW8 蛋白家族的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of RPW8 proteins in apricot,Pear,peach,arabidopsis,poplar

目前RPW8基因家族的分析还比较少，从家族成员数量上来看，杏中共鉴定出16 个家族成员，大于拟南芥（6 个）、油菜（7 个）、桃子（12 个）、梨（12 个）。据此推断，RPW8家族的成员数量在杏上得到了扩展。

对于RPW8基因功能研究较多，已经在多种植物中进行了分析，对于其抗病机理也进行了一定研究。Wang 等[28]发现RPW8.2中苏氨酸、缬氨酸、天冬氨酸在对抗白粉病抗性中至关重要，同时发现两个赖氨酸或精氨酸富集区域与N末端跨膜域一起构成了RPW8.2定位于吸器外质膜的靶向信号。杏RPW8家族基因以亮氨酸（Leu）赖氨酸（Lys）为主，说明在抗白粉病中能起到一定作用。

基因结构分析发现RPW8家族基因内含子数量小于6，基因LWMRPW8-3、LWMRPW8-5、LWMRPW8-8、LWMRPW8-10、LWMRPW8-11、LWMRPW8-13、LWMRPW8-14无内含子仅含有1个外显子数，说明杏 RPW8 家族成员基因容易受外界环境干扰。

聚类分析中LWMRPW8-7与其他杏RPW8家族成员同源性较低，分析发现LWMRPW8-7位于1 号染色体，大部分基因（LWMRPW8-1、LWMRPW8-2、LWMRPW8-3、LWMRPW8-6、LWMRPW8-8、LWMRPW8-9、LWMRPW8-12、LWMRPW8-13、LWMRPW8-15、LWMRPW8-16）位于7号；4个基因（LWMRPW8-5、LWMRPW8-10、LWMRPW8-11、LWMRPW8-14）位于5 号染色体，LWMRPW8-13位于4号染色体。

图4 杏RPW8 基因在不同组织中表达Fig.4 Expression profile of RPW8 gene in Apricot

有研究发现，RPW8介导的白粉菌抗性受到环境异质性的影响[29-31]。生产过程中发现杏在河南的白粉病发病率明显高于内蒙，特别是行间距较小情况下更易染病，因而在杏种植过程中选择适合的行间距，保证通风条件良好、避免形成高温高湿的小环境。

对杏RPW8基因在不同组织中的表达进行分析，结果显示16 个基因在花、花芽、叶片、果肉、果仁中的表达呈现较大差异，说明杏RPW8基因具有较高的组织表达特征，部分同源基因功能可能发生分化。研究结果为RPW8基因功能研究及抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育种提供理论基础。下一步将对杏RPW8基因家族的功能进行进一步开发研究。