粗毛纤孔菌三萜的提取及胆酸盐结合研究

刘爽爽，王昀睿，李德海

（东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

血脂异常是造成动脉粥样硬化等疾病的重要因素。控制血脂水平异常，降低体内胆固醇的含量，可有效减少这些疾病的发生[1]。胆酸盐是胆汁中由胆固醇衍生而来的具有甾核结构的一类两性大分子，可以通过对胆固醇和脂肪的消化吸收引起血脂水平升高。因此将胆酸盐排出体外可降低胆酸盐在肝肠循环过程中的积累，促进胆固醇的代谢，达到降血脂的目的[2]。目前辛伐他汀是通过吸收胆酸盐降低高血脂症的一种有效合成药物，但是长时间服用会有损害肝肾、血糖升高等副作用[3]。因此，开发有效降低血脂的天然功能性成分药物成为热点。研究表明三萜类化合物是一类有较好降血脂作用的天然产物，具有广泛的开发和应用前景[4]。

粗毛纤孔菌Inonotus hispidus又名粗毛黄孔菌，是一种以寄生为主的药用真菌，该菌在国内主要分布于北京、河北、黑龙江等北温带地区，东北常见于水曲柳上，西北地区常见于桑树。常被用来治疗消化不良、癌症、糖尿病等疾病[5]。研究表明，粗毛纤孔菌中含有多种抗肿瘤等疾病的天然成分，其中三萜类化合物就是一种重要的活性成分[6]。目前，关于提取方法对三萜类化合物提取率影响的研究已有报道。采用水浴法提取IHT，提取率可以达到4.59%[7]。采用双水相超声波法提取桦褐孔菌三萜，三萜提取率比常规超声波法提高0.8%[8]。采用响应面优化超声波法提取走马胎总三萜，提取率可以达到6.88%[9]。同时还有报道不同提取方法对三萜类化合物提取率及功能的影响。李德海等[10]研究了不同提取技术对IHT 提取率及体外降血脂功能的影响，其中高剪切技术的三萜提取率及胆酸盐结合量最大。但是关于提取方法过程中工艺参数对三萜类化合物降血脂活性影响的研究还鲜有报道。因此，本试验基于超声波可以通过机械效应和空化效应破坏细胞结构，使溶剂迅速渗透到样品组织细胞中，提高有效成分溶出速率，同时可以有效避免高温造成的活性成分降解和功能下降的优点和双水相分离迅速、提取条件温和、提取效率高等优点[11,12]。以粗毛纤孔菌子实体为原材料，在体外模拟生物体内环境，通过超声波与双水相技术联用，研究了有机溶剂、有机溶剂体积分数、盐的种类、盐浓度、料液比、超声温度、超声功率和超声时间8 个因素对IHT 提取率以及结合胆酸盐能力的影响，以探寻利用超声耦合双水相提取技术提取IHT 及保留降血脂活性的最佳条件，为选择IHT 的高效提取方法及开发新型降血脂药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

粗毛纤孔菌子实体：于2018年9月份在东北林业大学林场的水曲柳上采摘粗毛纤孔菌子实体，将其体置于42 ℃烘箱中烘干，用小型粉碎机粉碎，过60 目筛，收集筛下物，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂与设备

试剂：白桦脂醇，天津一方试剂有限公司；香草醛、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯，伊事达试剂公司；胆酸钠、牛磺胆酸钠，上海金穗生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 Biotopped 公司；所有试剂均为分析纯，无需进一步处理，直接使用。

设备：HY-200 标准筛（60 目），北京祥宇伟业仪器设备有限公司；KQ-300V 台式超声波清洗机，拓赫机电科技有限公司；DK-8D 电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限责任公司；722s 型紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；IS-RSDS型台式恒温振荡器，上海捷呈实验仪器有限公司；TGL-16G 台式离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-52 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器公司。

1.2.2 超声波辅助双水相技术提取IHT 工艺的研究

准确称取粗毛纤孔菌子实体粉末3 g，按一定液料比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（mg∶mL））分别加入一定体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）的溶剂（乙醚、乙醇、丙酮、异丙醇）和一定质量分数浓度（0.15 g/mL、0.20 g/mL、0.25 g/mL、0.30 g/mL、0.35 g/mL、0.40 g/mL）的盐溶液（NaCl、Na2SO4、(NH4)2SO4）构成双水相体系，在一定超声温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、超声功率（150 W、180 W、210 W、240 W、270 W、300 W）、超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）的条件下进行超声波耦合双水相提取，超声处理后在室温浸泡2 h，然后于转速4 800 r/min 条件下离心10 min，得到上清液，即为粗毛纤孔菌子实体三萜类化合物提取液。最后分别测定IHT 提取率和胆酸盐的结合量，通过数据分析确定超声波辅助双水相技术提取IHT 工艺。

1.2.3 不同提取方法的比较

准确称取粗毛纤孔菌原料粉末3 g，分别用双水相萃取法[8]溶剂法[13]、超声辅助溶剂法[14]和高剪切辅助提取法[10]提取IHT，将提取得到的溶液按照上述方法测定IHT提取率和胆酸盐的结合量。

1.2.4 IHT 提取率的测定

三萜类化合物标准曲线的绘制：根据参考文献[15]并稍作修改，准确称取白桦脂醇标准品50 mg，溶于50 mL 无水乙醇，混合得到标准溶液（1 mg/mL），吸取标准溶液1.00 mL，分别稀释10、50、100、150、200、250、300 倍，吸取稀释后的标准溶液1.00 mL，置于5 mL 容量瓶中，在100 ℃水浴蒸干后加入0.2 mL 新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL 高氯酸，摇匀后放入温度为70 ℃的水浴锅中反应15 min 后，常温下放置3～5 min，再加入乙酸乙酯定量到5 mL，摇匀，用不加样品的溶液做空白对照，在551 nm 处测定吸光度（OD 值）。以白桦脂醇浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线，得到的回归线方程为y=0.009 1x+0.039 7（R2=0.995 7）

IHT 提取率的测定：吸取IHT 提取液1 mL 以80%丙酮定容至5 mL。然后吸取1.00 mL 至5 mL容量瓶中即得到待测液，按照上述方法测定吸光值，重复3 次，按照下列公式计算IHT 的提取率。

式中：V为提取液体积（mL）；C为提取液中IHT 的质量浓度（mg/mL）；M为被测样品的质量（mg）；N为提取液的稀释倍数。

1.2.5 胆酸钠、牛磺胆酸钠标准曲线的测定

参考刘荣等[16]报道的方法并稍作修改，分别配制并移取不同梯度浓度的标准胆酸盐溶液（胆酸钠0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，牛磺胆酸钠0.1、0.2、0.3、0.4、0.50 mmol/L）2 mL 于具塞试管中，加入6 mL 质量分数60%的H2SO4溶液，在70 ℃下恒温放置20 min，取出后冰浴5 min，在387 nm 处测定吸光值。以胆酸盐浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制胆酸盐的标准曲线分别为y=1.102x+0.023，R2=0.9975，y=2.219 1x-0.001，R2=0.998 4。

1.2.6 胆酸盐结合能力的测定

参照文献[17]稍作修改，取3 mL（40 mg/mL）样品，依次加入3 mL（10 mg/mL）的胃蛋白酶，1 mL（0.01 mol/L）的HCl 溶液，在37 ℃恒温振荡消化1 h 后，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液调节pH值为6.3，然后再加入5 mL（10 mg/mL）胰酶，接着在37 ℃恒温振荡消化1 h。最后每个样品中加入4 mL 胆酸盐溶液（牛磺胆酸钠浓度为0.5 mmol/L，胆酸钠浓度为1 mmol/L）。在37 ℃恒温水浴锅中振荡1 h 后，在4 000 r/min 下离心20 min，对上清液中的胆酸盐进行测定。计算公式如下：

胆酸钠结合量（μmol/100 mg）=胆酸钠加入量-剩余量；

牛磺胆酸钠结合量（μmol/100mg）=牛磺酸胆酸钠加入量-剩余量。

1.3 统计学分析

实验中的数据均平行测定3 次，以±s表示，基础数据统计采用Excel 软件，图表均采用 Origin 9.0 处理完成，显著性分析采用SPSS 21.0软件，不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05），相同字母表示差异性不显著（P＞0.05）。

2 结果与分析

2.1 超声波耦合双水相提取IHT 条件的筛选及对胆酸盐结合量的影响

2.1.1 有机溶剂对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

由图1可知，4 种有机溶剂对IHT 提取效率和胆酸盐结合量的影响有明显地差异（P＜0.05），丙酮作为提取剂时IHT 提取率和胆酸盐的结合最大，分别为提取率2.50%、胆酸钠结合量0.58 μmol/100 mg、牛磺胆酸钠结合量 0.33 μmol/100 mg。乙醚作为提取剂时IHT 提取率和胆酸盐的结合量最小。结合相似相溶原理，可能是丙酮的极性与IHT 极性相近，其构成的双水相体系不仅有利于IHT 的溶解还可以增强IHT 在肠道内与胆酸盐结合的能力[18,19]，故选择丙酮为有机溶剂。

图1 有机溶剂种类对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.1 Effect of organic solvent type on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.2 有机溶剂体积分数对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

由图2可知，丙酮的体积分数在60～80%之间时，IHT 提取率随丙酮体积分数的增大而提高。在80～100%时，IHT 提取率随丙酮体积分数的增大而降低。可能是由于丙酮体积分数的增大，提高了丙酮结合水分子的能力，下相中的水分子因竞争吸附到上相中，提高了IHT 提取能力但随着丙酮体积分数逐渐增加，样品的水溶性成分在有机相中溶解性增加，抑制了三萜的溶出[20]。IHT 胆酸盐结合量的变化趋势与IHT 提取率一样。三萜类化合物在体内常与多糖等形成三萜皂苷，随着丙酮体积分数的增加，溶剂对苷键的破坏能力增强，从而增加IHT 结合胆酸盐的能力，但丙酮的体积分数过高，溶剂的极性降低会影响极性较小的IHT 的化学结构完整性，从而降低了IHT 结合胆酸盐的能力[21]。故丙酮的最佳体积分数为80%。

2.1.3 盐的种类对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

图2 有机溶剂体积分数对IHT 提取率及胆酸盐结合量的 影响Fig.2 Effect of organic solvent volume fraction on IHT Extraction Rate and bile salt binding amount

图3 盐的种类对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.3 Effects of salt types on IHT extraction rate and bile salt binding amount

如图3所示，当盐为硫酸铵时，IHT 提取率与胆酸盐的结合量最大，分别为提取率3.52%、胆酸钠结合量0.83 μmol/100 mg、牛磺胆酸钠结合量0.59 μmol/100 mg，可能的原因是硫酸铵的铵根离子与水的氢氧根离子结合改变了提取液的pH 值，造成胆酸盐的溶解性和阴离子化程度增大，胆酸盐结合IHT 的基团暴露，从而提高了胆酸盐的结合量[22]。硫酸铵盐析效应可以在一定程度上提高和改善相分离能力，从而提高了硫酸铵的IHT 提取率[23]。虽然硫酸铵能提高IHT 提取率，但各种盐对IHT 提取率无显著性（P＞0.05）的影响，同时考虑到硫酸铵的价格相对便宜，容易购买，可以减少试验中的支出，而且溶解度大不受温度变化的影响。故盐的种类选择硫酸铵。

2.1.4 盐浓度对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

由图4可知，在0.15～0.20 g/mL 之间随着硫酸铵质量浓度的增大，三萜类化合物的提取率逐渐增大。随着硫酸铵质量浓度的增加，硫酸铵与水的结合能力提高，丙酮的极性增大，三萜类化合物能更好的转移到有机相中[24]。硫酸铵质量浓度在0.20～0.35 g/mL 之间时，IHT 提取率下降。由于双水相形成的过程是丙酮和硫酸铵争夺水分子的过程随着盐浓度的增加，顶相的体积减小，

图4 盐浓度对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.4 Effect of salt concentration on IHT extraction rate and bile salt binding amount

从而导致目标化合物的减少[25]。在0.15～ 0.20 g/mL 之间胆酸盐结合量随着硫酸铵质量浓度的增大而增大，硫酸铵质量浓度超过0.20 g/mL时，胆酸盐结合量随着硫酸铵质量浓度的增大而减少，可能是硫酸铵增加降低了提取液的pH 值，胆酸盐的溶解性和阴离子化程度增大，胆酸盐结合IHT 的基团暴露，pH 值太低时虽然胆酸盐的结合位点增多但IHT 较难以离子键的形式与胆酸盐发生作用[22,26]。故选择盐浓度为0.20 g/mL。

2.1.5 料液比对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

由图5可知，当料液比在1∶3～1∶6 之间时，IHT 的提取率随料液比的增大而增大， 1∶6 之后提取率趋于平缓。因为较高浓度的料液比不仅通过在内部细胞和外部溶剂之间产生浓度差来提高提取效率，还有利于质量传递。但是由于对传质的限制更多地局限于固体内部，太多的液体增多也不会再改变驱动力[27]。当料液比在1∶3～ 1∶6 之间时，IHT 的胆酸盐结合量随料液比的增大而增大，1∶6 之后降低。这是因为随着溶剂的体积增加，超声和微波介电分子也会增加，将导致IHT结合胆酸盐的活性部分暴露，结合更加充分。但溶剂的体积太大就会导致超声和微波介电分子太大，从而破坏IHT 的结构[28,29]。故选择料液比为1∶6。

图5 料液比对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.6 超声温度对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

如图6所示，当超声温度在20 ℃～35 ℃之间时，IHT 的提取率随温度的增大而提高，温度超过35 ℃，IHT 的提取率随温度的增加而降低。IHT 胆酸盐结合量的变化趋势与IHT 提取率一致。可能由于温度的升高，加速了IHT 分子的运动，增加了提取溶液对IHT 的传导性使三萜类化合物的溶解更加完全，同时温度升高也有利于IHT 结合胆酸盐的活性部分暴露[30]。但温度过高，不仅造成提取剂的挥发,还可能造成IHT 结构的破坏、分解、氧化[31]。故温度选择35 ℃为最佳。

图6 超声温度对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.7 超声功率对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

如图7所示，当超声功率在150～240 W 之间时，IHT 提取率随超声功率的增大而提高，当超声功率在240～300 W 之间时，IHT 提取率随超声功率的增大反而降低。随着超声功率的增大提取液中会产生很多温度高并且压力大的汽泡，气泡瞬间破裂时会产生强烈的冲击波和高速射流，加速溶剂渗透到细胞组织内通过破坏的细胞壁，将产物释放到溶剂中[30]。IHT 胆酸盐结合量的变化趋势与IHT 提取率一致。可能是由于超声功率的增大使IHT 结合胆酸盐的活性部分暴露，结合更加充分，但超声功率继续增大，超声的空化效应和热效应均增大就会造成IHT 结构的破坏[29,32]。故超声功率选择240 W。

图7 超声功率对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.7 Effect of ultrasonic power on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.8 超声时间对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

由图8可知，超声时间在20～40 min 之间时，IHT 提取率随超声时间的延长而提高。当超声时间在40～100 min 之间，IHT 提取率随超声时间的不断延长而降低。由于超声波引起的空化效应，使所有的细胞破裂，增大了溶剂和材料之间的接触面积。超声产生的空化微气泡破裂时将促进溶剂渗透到细胞中以溶解其中存在的大多数三萜，并且空化微气泡数量随着提取的持续时间的延长而增加[33]。但超声时间过长，超声不仅将除三萜类化合物之外的其它杂质溶出，超声热效应还会引起温度的升高使三萜类化合物分解[34]。IHT 胆酸盐结合量的变化趋势与IHT 提取率一致。可能是由于超声时间的延长有利于IHT 活性部分暴露但当继续超声时，长时间的仪器工作产生的热能会使温度升高，致使三萜降解或是异构化[30,35]。故选择超声时间为40 min。

图8 超声时间对IHT 提取率及胆酸盐结合量的影响Fig.8 Effect of ultrasonic time on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.2 不同提取方法对IHT 提取率和胆酸盐结合量的影响

由表1可知，超声波耦合双水相提取技术提取IHT 的提取率和胆酸盐结合量均最大，其提取率为5.08±0.08%，胆酸钠和牛磺胆酸钠结合量分别为1.49±0.12 μmol/100 mg、0.81±0.11 μmol/100 mg，其次是超声波辅助溶剂法、高剪切辅助溶剂法和双水相萃取法。溶剂法提取IHT 的提取率和胆酸盐结合量均最小，其提取率仅为2.56±0.13 %，胆酸钠和牛磺胆酸钠结合量分别为0.62±0.04 μmol/100 mg、0.21±0.10 μmol/100 mg。由表看出不同的提取技术因提取原理的不同提取效果存在显著差异（P＜0.05），超声耦合双水相提取法可以利用超声波的空化效应使活性成分溶出，且体系的温度不会大幅度升高，不会破坏三萜分子结构，从而提高了三萜的提取率及胆酸盐结合量[36]。双水相因分子间氢键、电荷相互作用、界面性质等多种作用的影响，使三萜类化合物快速的从浓度差异大的两相间分离出来，从而增大了三萜的提取率，使三萜类化合物与胆酸盐的结合量增大[10]。超声波辅助溶剂法缩短了溶剂提取法的提取时间，不仅提高了IHT 的提取率还避免IHT 因氧化丧失生物活性而降低三萜的胆酸盐结合量[14]。高剪切辅助溶剂法利用高剪切转子高速旋转产生的剪切力加速胞内IHT 溶出的同时还能有效避免三萜因热效应发生结构的变化，提高了三萜的提取率与胆酸盐结合量[37]。溶剂法是对样品加热提取的一种方法，因提取时间长，提取温度高造成IHT 含量的损失和结构的破坏，大大降低了三萜的提取率和胆酸盐结合量[13]。因此超声波耦合双水相提取技术不仅可以提高三萜类化合物的提取率还有效保护三萜类化合物的结构使其具有良好的降血脂作用。

表1 不同提取方法的结果及比较†Table1 The results of different extraction methods and comparison

3 结 论

本实验以IHT 提取率和胆酸盐结合量为指标，通过单因素试验对超声波耦合双水相体系提取技术进行优化，得出最佳提取工艺条件为：丙酮体积分数80.0%、(NH4)2SO4质量浓度0.21 g/mL、料液比1:5，超声功率240.0 W、超声温度35 ℃、超声时间40 min，在此条件下IHT 的提取率为5.08%，胆酸钠结合量为1.52 μmol/100 mg，牛磺胆酸钠结合量为0.81 μmol/100 mg，与其它提取方法相比，超声耦合双水相体系提取IHT 不仅在操作方面上更为方便，时间短，提取率高，而且能更好的保护三萜的结构使其具有良好的降血脂效果。因此超声耦合双水相体系提取技术具有较好的发展前景。

试验通过优化超声耦合双水相萃取技术工艺参数提高了IHT的得率并改善了IHT的降脂功能，但对于工业化生产还有一段距离，因此关于IHT的实际生产仍需进一步研究。此外关于提取方法过程中工艺条件对三萜类化合物结构和降血脂功能关系的影响机制仍需进一步研究探讨。粗毛纤孔菌作为一种药用真菌，对人体有保健作用，对疾病有治疗、预防或抑制作用。因此，研究开发粗毛纤孔菌的功能成分尤其是IHT，对药用真菌的研究利用具有重要意义。