中国维吾尔族人群HCN1基因多态性与精神分裂症风险的关联研究

李秀丽，马川川，陈剑华，潘 敦，贺 林，伊琦忠，师咏勇

(1.安徽医科大学 生命科学学院 遗传学系，安徽 合肥 230031; 2.Bio-X研究院，发育和神经精神疾病 遗传学重点实验室(教育部)和上海交通大学脑科学协同创新中心，上海 200030; 3.上海交通大学医学院 上海市精神卫生中心上海市精神病学重点实验室，上海 200030; 4.新疆医科大学第一附属医院心理医学中心，新疆乌鲁木齐 830054)

精神分裂症是一种慢性严重致残的精神疾病，在全世界人群中普遍存在，终生患病率约为0.5%～1%[1].精神分裂症给患者、亲属及整个社会带来了极大的痛苦与沉重的负担[2].这种疾病的临床症状复杂多样，常见症状有幻觉，妄想，沟通混乱，计划不周，动机减少和情绪紊乱等[3].精神分裂症的病因迄今为止尚不明确，且病程多种多样，发病年龄大多在16至40岁之间.双生子、领养子和核心家系的流行病研究表明，它是一种高度遗传性的精神疾病(遗传率约为70%～85%)[4-6].在过去十几年中，全基因组关联研究(GWAS)已经发现许多精神分裂症的风险基因，这些基因在预测疾病风险、精神分裂症药物的研发方面显示出独特的临床价值.超极化激活的环核苷酸门控(HCN)通道是一种非选择性的电压门控阳离子通道，由4个编码基因(HCN1、HCN2、HCN3、HCN4)组成，该通道在神经元的产生和心脏自律性方面起着重要作用[7-8].相关研究发现HCN通道的转录水平和蛋白水平在中枢神经系统中广泛表达[9-10].在这4种编码基因中，HCN1基因是钾通道亚基和大脑内向超极化激活的电流(Ih)的主要贡献者，Ih广泛参与神经系统的生理功能，如静息膜电位的稳定、神经递质的释放、调节神经元兴奋性、节律活动和突触可塑性[11-13].随后的研究相继发现在大脑中HCN1基因是HCN通道的主要成分，且在新皮质、海马CA1区域、小脑皮质和脑干中高度表达[14-15].相关的研究发现，HCN1在海马区广泛表达，对大鼠该基因敲除后，会导致严重运动学习和记忆障碍[16].显然，这些学习和记忆的认知障碍都可能导致精神疾病.此外，一些研究发现HCN1蛋白可用作治疗焦虑和抑郁的潜在药物靶标[17].更重要的是，将HCN1转染到培养的海马神经细胞中，发现原代培养的海马神经细胞和转染后的海马细胞中HCN1的表达量均具有谷氨酸依赖性: 随着谷氨酸与其受体结合，HCN1的表达量会相应增加.随后还发现HCN通道的突触后电流Ih可抑制谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的突触传递[18-19].而近年来许多研究者将突触上的谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)以及突触外的氨基酸能递质受体作为参与精神分裂症疾病的病因学假说进行研究，从而进一步支持了HCN1基因可能与精神分裂症有关联的假说[20].在2014年，一项精神分裂症全基因组关联研究联盟(Schizophrenia Psychiatric GWAS Consortium, PGC)在欧洲和东亚人群中新发现108个精神分裂症相关的位点，其中HCN1基因是首次发现与精神分裂症可能存在着关联(P=5.05×10-9)[21].在2017年，我们课题组基于36180份样本，完成了中国汉族人群全基因组关联分析及验证，同时结合PGC2的欧洲样本数据，开展了大样本跨种族分析以及精细定位研究，发现了30个新的精神分裂症易感位点.此项研究中也发现了欧洲人群中HCN1内含子区域上的位点rs9292918，与精神分裂症显著相关(P=4.47×10-11)[22].这些研究强有力地证明了该基因可能是精神分裂症的风险基因.

自从2006年以来，精神疾病的GWAS已经在欧洲和亚洲不同种群间超过10万个样本进行研究，到目前为止我们已经发现了数百种新的疾病易感位点[6，21-29].之前的研究证明HCN1基因在欧洲人群中与精神分裂症有关.然而，由于潜在的遗传异质性，在一个群体中发现的遗传变异可能在其他群体中并没有显著关联.因此，本研究探索了中国新疆维吾尔族人群中精神分裂症与HCN1基因之间的关系.新疆自古以来就是欧亚大陆东西方人群的融汇之地，也是古“丝绸之路”的必经之地，在欧亚大陆人群迁徙和演化史上扮演着重要的角色，同时也造就了新疆人群的复杂多样性[30].之前的报道认为维吾尔族人群是汉族和西欧人群基因交流的混合结果[31].最近一项研究分析了涵盖新疆全境近千例维吾尔族样本的基因组数据，从遗传学角度对维吾尔族的群体结构、祖源构成和人群融合历史做了一个较为全面的解析，发现维吾尔族人口的遗传成分主要来自欧亚大陆东、南、西、北4个方向的分化群体[32].

鉴于HCN1基因研究的现状，本研究是第一次在中国维吾尔族人群探索HCN1中的常见变异是否会导致精神分裂症的风险.在本文中，为了研究HCN1是否在精神分裂症中发挥重要作用，我们对985名患者和1218名正常对照中的5个位点rs12519313，rs10060015，rs16902112，rs16902197和rs12659024进行了全面的基因分型，并且还分析了两个推算的SNPs(rs1501357，rs9292918).

1 材料和方法

1.1 研究对象

本研究的对象是中国新疆维吾尔族人群，其中包括985例精神分裂症患者(612例男性和373例女性，平均发病年龄为(39.45±12.12)岁)和1218例健康对照(629例男性和589例女性，平均发病年龄为(43.07±13.14)岁).精神分裂症患者是由两位主任级精神科医生依据DSM-4诊断标准独立诊断.正常对照是由精神科医生通过简单的访谈从正常维吾尔族人群中随机挑选，年龄和性别与患者大致相匹配，并且没有心理健康问题或神经疾病史.该研究获得了所有参与者的知情同意，并得到了当地伦理委员会的支持.

1.2 DNA提取、SNP的选择和分型

基因组DNA样本是通过Quick Gene DNA whole blood试剂盒(Fujifilm, Life Sciences Products, Tokyo, Japan)根据制造商提供的标准化方案来提取.使用Nano drop ND-1000(Thermo Scientific, DE, USA)分光光度计来进行评估基因组DNA的质量.HCN1基因位于5号染色体上，大小为441.38bp；它由6个外显子和5个内含子组成.标签SNPs的选取是通过Haploview软件4.2版本，按照R2≥0.5和最小等位基因频率(MAF)≥0.05的原则进行筛选[33].对5个标签SNPs(rs12519313, rs10060015, rs16902112, rs16902197, rs12659024)进行基因分型.此外，这5个标签SNPs和两个推算SNPs(rs1501357，rs9292918)均位于基因的内含子区域.7个位点的详细信息位于表1中.本研究采用Mass ARRAY iPLEX Gold平台(Sequenom Inc., San Diego, CA)对SNP进行分型.基因分型的实验步骤与之前研究中所描述的常规方法相同[34].所有的样本都有相对较高的分型结果且检出率高于95%.

表1 HCN1基因中7个SNP的位点信息

1.3 数据分析

我们在SHEsis软件平台上进行了哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)检验、连锁不平衡(LD)检验、等位基因关联分析、基因型关联分析和单倍型分析(http:∥analysis.bio-x.cn/SHEsis.html)[35-36].通过拟合优度的卡方检验来测试每组中的HWE，以及病例和对照之间的等位基因和基因型分布差异.此外，使用D′和R2值去衡量连锁不平衡程度.当双端P<0.05，并且在Bonferroni校正后P<0.05，结果才被认为有统计学意义.

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡和连锁不平衡

表2 病例组和对照组检出率和HWE值

我们不仅在病例组和对照组中进行HWE检验，还分析了这5个位点间的连锁不平衡.HWE检验结果显示对照组中除了位点rs16902112的P<0.05外，其余位点的P值均大于0.05，故rs16902112偏离HWE，在后续的研究中舍弃该位点.所有位点HWE检验的详细信息见表2.连锁不平衡的结果表明在5个位点中，rs12519313与rs16902112、rs16902197、rs12659024, rs10060015与rs16902112，rs16902112与rs12659024，rs16902197与rs12659024之间具有强烈的连锁不平衡，且位于同一个区块内(D′>0.95)，如图1(a)所示.

此外，我们基于本次研究的数据和以前GWAS研究的数据来分析两个推算的SNPs(rs9292918和rs1501357)与本研究的5个SNPs之间的连锁不平衡.连锁不平衡的结果见图1(b)，在这些位点中，rs9292918与rs10060015，rs9292918与rs1501357，rs16902112与rs10060015以及rs10060015与rs1501357之间具有强烈的连锁不平衡，且位于同一个区块内.

图1 HCN1基因上SNPs位点之间的连锁不平衡Fig.1 Linkage disequilibrium among SNPs of the HCN1 gene(a) 中国维吾尔族人群HCN1基因中5个标签SNPs之间的连锁不平衡.区块中的数字是两点之间的D′值.当数值越大时，连锁不平衡越强.当值越小时，连锁不平衡越弱.(b) 基于该研究的结果和先前的GWAS结果在中国人群中，两个推定的SNP(rs1501357，rs9292918)和5个标签SNP之间的连锁不平衡.区块中的数字是两点之间的R2值.当数值越大时，连锁不平衡越强.当数值越小时，连锁不平衡越弱.

2.2 单个位点和单倍型分析

5个SNPs的基因分型结果见表3、表4、表5、表6中.在表3中，我们未发现在健康对照与精神分裂症病例之间的等位基因或基因型分布有显著差异(在Bonferroni校正之前P>0.05).为了进一步验证结果，我们对研究对象进行了性别分组分析.详细的分析结果示于表4和5中，结果显示男性和女性组之间也没有显著统计学意义.此外，表6显示所有位点在病例和对照之间的单倍型分布也没有显著统计学意义.

表3 病例组和对照组中等位基因和基因型的分布

表4 男性组等位基因和基因型的分布

表5 女性组等位基因和基因型的分布

(续表)

表6 HCN1基因单倍型的分析

3 讨 论

在过去的几十年中，很多研究已经证明HCN通道介导超极化激活电流(Ih)，而且在神经系统中广泛表达，在调控神经兴奋和网络活动方面具有显著作用[37-38].最近研究还发现HCN1通道可调节灵长类动物背外侧前额叶皮层(PFC)中神经元的兴奋性，而且脊柱中的HCN1通道与环磷酸腺苷(cAMP)相关蛋白(DISC1: 精神分裂症断裂基因1，D1R: 多巴胺D1受体)共表达，这与精神分裂症中学习记忆失调有关[39].此外，许多研究报道了HCN1通道调控许多脑认知的生理过程，例如睡眠、学习和记忆等[12，16，40].而近年一些研究者发现HCN通道电流Ih与疾病癫痫发生中表达的上调，功能的增强有关，且突触上的NMDA和GABAA受体以及突触外的氨基酸能递质受体可能与癫痫的发病机制有关[19，41].其他研究表明，在神经系统中HCN通道的异常调节可能与许多神经系统疾病有关，如心律失常，癫痫，阿尔茨海默病和神经性疼痛，这使HCN通道成为治疗探索的新目标[11，42-45].在2014年，精神病学基因组协会-精神分裂症工作组(PGC-SCZ)发表一项GWAS研究，确定了一百多个遗传基因位点，并且第一次发现欧洲人群中HCN1基因内含子区域上rs1501357可能是精神分裂症风险位点[21].在2017年，我们课题组一项GWAS研究发现30个新的精神分裂症易感位点，并且在欧洲人群中发现HCN1上的rs9292918位点，这是继rs1501357发现后的又一个与精神分裂症可能相关的风险位点[22].这些研究都进一步支持了本文的假说HCN1基因可能与精神分裂症风险有关.

本文的研究旨在探索HCN1在中国维吾尔族人群中与精神分裂症的关系，但是并没有发现两者之间有显著的相关.接下来，我们基于之前GWAS的研究结果与本实验的结果，进行了HCN1基因上5个标签SNPs之间的连锁不平衡检验，和两个推算SNPs与另外5个标签SNPs之间的连锁不平衡检验.如图1(a)所示，5个标签SNPs间存在连锁不平衡，图1(b)则展示了rs9292918与rs10060015, rs9292918与rs1501357, rs16902112与rs10060015以及rs10060015与rs1501357位点位于一个区块内，且存在连锁不平衡.由于两个推算的SNPs位点与另外5个标签位点都位于同一染色体上，可通过连锁不平衡(LD)来反映同一染色体上不同基因座上等位基因的非随机关联情况.根据LD的结果，我们可以推算出在维吾尔族人群中，这两个推算的位点也可能与精神分裂症的风险无关.

我们目前的研究存在以下3方面的局限性，这些局限性可能会导致结果呈现出阴性.(1) 考虑到HCN1的分子大小为441.38bp，本实验选择的标签SNPs的数量相对较少，而且这些SNP都是HCN1基因内含子中的常见等位基因(MAF>0.05)，其可能不直接影响该基因的功能或表达.(2) 精神分裂症是复杂疾病且具有遗传异质性，新疆维吾尔族人群是一个混合的人群，有研究报道其祖先主要来自欧洲和亚洲，但具体的种群结构仍不清楚[32].HCN1基因多态性在不同群体中有显著差异.例如，在千人基因组(1000 genomes)数据库中，发现rs12519313-A在汉族人群(CHB)中的患病率较高(14.08%)，而欧洲人群(CEU)患病率较低(2.02%).rs10060015-G在CHB中等位基因频率为33.98%，而在CEU中频率为18.18%；rs16902112-C在CHB中等位基因频率为14.56%，在CEU中频率为0%；rs16902197-C在CHB中等位基因频率为11.17%，在CEU中频率为0%；rs12659024-T在CHB中等位基因频率为13.59%，在CEU中频率为7.58%.这些数据都表明了汉族和欧洲人群之间存在显著的种族差异，从而解释了该研究结论的不一致性.由于社会文化，生活习俗和环境暴露等因素的差异，汉族或欧洲人群中发现的精神分裂症易感基因(CMYA5、ANK3、GRM7和亲和素β3基因等)，在维吾尔族人群中并没有得到验证[46-49].(3)我们根据本研究的样本量和最小等位基因频率(MAF)用Quanto软件(http:∥biostats.usc.edu/Quanto.html)计算了rs12519313、rs10060015、rs16902197、rs12659024 4个位点的统计检验能力，具体结果见表7.4个位点的统计效力均在99%以上，证明本研究的样本量足以得出阴性结论.我们的研究虽然表明HCN1不是中国维吾尔族人群精神分裂症的风险基因，但是不排除该基因可能通过与其他基因相互作用而导致精神分裂症，或者可能与该病的某些内表现有关.尽管本实验没有发现HCN1基因与中国维吾尔族人群精神分裂症有关联，但是对精神分裂症药物基因组学后续的研究有一定的参考价值.

表7 统计效力的分析