SB-525334下调肝星状细胞miR-19b和miR-29b的表达

吴江华 马俊骥 郭昱 郭平

肝纤维化进展时转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以促使肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)产生大量胶原沉积[1]。肝硬化后miR-29b和miR-19b表达均下调，TGF-β1可抑制miR-29和miR-19b的表达，给予miR-19b 和miR-29类似物可以抑制HSC 活化，并减轻肝纤维化的发生[2,3]。SB-525334 是一种强效小分子抑制剂，能够选择性抑制TGF-β I型活化素受体样激酶(activin receptor-like kinase,ALK5)[4]。研究表明，SB-525334 可以选择性地抑制TGF-β1 受体从而抑制TGF-β介导的慢性肾损伤，但是SB-525334 对HSC的作用机制还不清楚。本研究观察TGF-β1 刺激HSC后SB-525334 对I 型胶原分泌、miR-29b和miR-19b表达的影响，以评估SB-525334 在肝纤维化防治中的作用。

资料与方法

一、细胞培养及MTT

HSC株人LX-2由美国Mount Sinai大学医学院惠赠。将LX-2细胞系于液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中，用含10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基重悬细胞，并接种于培养瓶中，在体积分数为0.05的CO2孵箱中37℃恒温培养。取处于对数生长期的细胞用于实验[5]。

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔培养板中每孔加入100 μL，铺板使待测细胞调密度 1×104个细胞/孔。体积分数为0.05的CO2、37℃孵育培养24 h，2% FBS培养基饥饿12 h，加入浓度梯度的干预因子，继续培养24 h，设5～7个梯度，3～5个复孔。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪A490 nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔和对照孔。根据吸光度值计算各TGF-β1不同干预浓度与干预时间的增殖率，以及SB-525334不同干预浓度与干预时间的抑制率。增殖率=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)，抑制率=1-(实验组-空白组)/(对照组-空白组)。为明确TGF-β1与SB-525334 处理LX-2细胞时最佳浓度，以未做任何处理的LX-2 细胞作为对照，分别观察TGF-β1在浓度为1、10、20、30 ng/mL时处理后LX-2细胞生长率、SB-525334在浓度为1、2、10、20 μmol/L时处理后的LX-2细胞生长率。为明确TGF-β1与SB-525334处理LX-2细胞最适时间，观察TGF-β1 、SB-525334在0、12、24、48 h处理后LX-2细胞生长率。

二、细胞分组与干预

将LX-2细胞种植于6孔培养板上，每孔约5×105个细胞，在10% FBS的DMEM中进行培养24 h，待细胞融合度达到60%时，改用1% FBS的DMEM饥饿处理12 h，分别设对照组、TGF-β1干预组、SB-525334 干预组、TGF-β1和SB-525334共同干预组，其中TGF-β1和SB-525334共同干预组先加入SB-525334，12 h后再加TGF-β1，在各组干预过程中均加入相同剂量的溶剂(DMSO、柠檬酸与BSA)，CO2孵育箱培养24 h后，收集细胞。

三、蛋白质印迹法检测I型胶原

采用RIPA裂解缓冲液制备细胞蛋白裂解液，-20℃保存。BCA法测定蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，PVDF膜转膜。PVDF 膜置于含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中于室温封闭1 h，将封闭后的PVDF膜置入TBST适当稀释的一抗溶液中，4℃过夜。以TBST 1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，于37℃反应1 h。实验用X胶片显影后采用Image J软件对结果进行定量分析，灰度值以累积吸光度值(IA)表示。

四、RT-qPCR检测miR-19b和miR-29b

吸除培养基，用PBS洗涤细胞，加入含有0.10%～0.25%胰蛋白酶处理，将细胞悬液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀。采用美国Ambin公司的mirVanaTMPARIS试剂盒提取miRNA，进行浓度及纯度测定后行miRNA反转录。

miRNA SYBR Green 荧光定量PCR以cDNA为模板检测miR-29b和miR-19b的表达水平，其引物序列如下，miR-19b：UGUGCAAAUCCAUGCAAAC-UGA，miR-29b：UAGCACCAUUUGAAAUCAG-UGUU；U6上游引物序列：CTCGCTTCGGCAG-CACA，下游引物序列：AACGCTTCACGAAT-TTGCGT，均由天根生化科技有限公司合成，引物浓度均为10 μmol/L。

PCR产物的相对定量使用比较阈值法进行定量分析。Ct值是指热循环仪中荧光达到荧光阈值所需的循环数，在测定目的基因Ct值的同时，测定同一样本内参基因的Ct值，从而对加入RNA量的差异进行校正。△Ct实验组=Ct目的基因-Ct内参基因，△Ct对照组=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组，2-△Ct表示目的基因的相对表达量，2-△△Ct表示实验组的目的基因相对于对照组的变化倍数。

五、统计学方法

计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较采用SNK检验、Tamhane’st2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、SB-525334抑制HSC增殖

TGF-β1 的浓度为1、10、20、30 ng/mL时，吸光度值为0.44±0.02、0.58±0.32、0.54 ±0.07、0.46±0.05，与对照组比较，细胞增殖以浓度依赖的方式呈现先增高后下降的趋势(P<0.05)，当TGF-β1浓度为10 ng/mL时，其生存率最高，为132.0%。SB-525334在浓度为1、2、10、20 μmol/L，吸光度的数值为0.53±0.05、0.51 ±0.04、0.41±0.05，0.40±0.06，SB-525334处理后与对照组比较，细胞抑制率以浓度依赖的方式呈现逐渐升高的趋势(P<0.05)，当SB-525334浓度为10 μmol/L时，其抑制率最强，为38.4%。

TGF-β1在0、12、24、48 h时，其吸光度值为0.27±0.07、0.29 ±0.07、0.31±0.07、0.30±0.06；SB-525334在0、12、24、48 h时其吸光度值0.32±0.07、0.3 ±0.06、0.28±0.06，0.30±0.06，TGF-β1与SB-525334在各个时间段对细胞的增殖无显著差异(P>0.05)，但是在24 h时两种药物对细胞的影响呈最大的趋势，因此选择药物处理24 h进行后续试验。

二、SB-525334抑制I型胶原的表达

对照组、TGF-β1组、SB-525334组、TGF-β1+SB-525334组I型胶原蛋白相对表达量分别为(17.89±4.27)%、(82.80±4.39)%、(34.63±5.37)%、(62.62±3.72)%，TGF-β1组I型胶原蛋白的表达量较对照组显著增高(P<0.01)，SB-525334组和TGF-β1+SB-525334组I型胶原蛋白的表达量较TGF-β1显著降低(P<0.01)，见图1。

注：1.对照组；2.TGF-β1干预组；3.SB-525334干预组；4.TGF-β1和SB-525334共同干预组

图1SB-525334对肝星状细胞株LX-2 细胞I型胶原表达的影响

三、SB-525334下调肝星状细胞miR-29b、miR-19b的表达

将对照组的miR-19b表达量设为1，TGF-β1干预组、SB-525334干预组、TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-19b相对表达量分别为0.62±0.07、0.28±0.06、0.64±0.20，各干预组LX-2细胞miR-19b相对表达量较对照组明显下降(P<0.01)，TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-19b的相对表达量较SB-525334组高(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干预组与TGF-β1干预组LX-2细胞 miR-19b的相对表达量比较无明显差异(P>0.05)。

将对照组的miR-29b表达量设为1，TGF-β1干预组、SB-525334干预组、以及TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-29b相对表达量分别为0.77±0.05、0.44±0.04、0.61±0.06，各干预组LX-2细胞miR-29b相对表达量较对照组下降(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞 miR-29b 的相对表达量较TGF-β1干预组低(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-29b的相对表达量较SB-525334干预组高(P<0.05)。

讨 论

急慢性肝脏损伤时，HSC活化、增殖，转变为肌成纤维样细胞，并分泌大量的α-SMA和细胞外基质蛋白，包括纤连蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原并具有收缩功能，从而导致纤维化的发生[5-7]。TGF-β1是HSC增殖强有力的刺激因子，本实验中也发现TGF-β1可以明显促进细胞增殖，给予TGF-β1抑制剂SB-525334后HSC数目减少，增殖明显受到抑制。SB-525334是一种强效小分子抑制剂，选择性抑制TGF-β1受体，本研究中发现SB-525334随着浓度升高对细胞生长抑制作用更加明显，当其浓度达到一定量后抑制作用稍有下降，因此SB-525334对HSC生长主要起抑制作用。

肝脏库普弗细胞刺激HSC活化时产生大量的TGF-β1[8]。肝纤维化时TGF-β1持续增加，激活Smad和MAPK信号通路，导致HSC分泌大量I型胶原。SB-525334是ALK5(TGF-β1 I型受体)的抑制剂，在肾脏RPTE细胞中可抑制Smad2/3的转位抑制肾脏纤维化发生[9]。本研究中，单独给予TGF-β1刺激的HSC的I型胶原蛋白表达明显升高，与之前研究相符。之后，再给予TGF-β1的抑制剂SB-525334干预后，HSC的I型胶原蛋白表达则明显降低，这表明SB-525334可通过抑制TGF-β1信号通路，抑制HSC细胞外基质的产生，进而发挥抑制肝纤维化的作用。

研究表明，miR-19b在肝纤维化进程中起重要作用。Lakner等[2]研究发现，miR-19b在活化的HSC中表达明显下降，miR-19b过表达通过抑制其靶基因 TGF-βRII ，而阻断 TGF-β信号通路，最终抑制I型胶原和α-SMA 表达。Sekiya等[10]研究发现，转染miR-29b前体可明显减轻I型胶原和II型胶原mRNA的表达，并且明显削弱HSC活化的基因如α-SMA、DDR2、FN1和PDGFR-β的表达。过表达miR-29b可使HSC处于静止状态，使胶原表达降低并抑制细胞增殖。在本研究中，miR-19b和miR-29b在TGF-β1刺激LX-2细胞后表达明显减少，与之前研究相符。本研究发现，SB-525334干预后的HSC miR-19b和miR-29b表达下降，与对肾纤维化的研究结果不符[4]。研究表明HSC中miR-29的表达下调是由PDGF-BB、TGF-β和炎症信号通路如LPS和NF-κB信号通路共同调节[4]。在本实验中SB-525334抑制TGF-β1信号通路的同时，可能反应性引起NF-κB信号通路激活，导致miR-19b和miR-29b表达下调，并抑制I型胶原的表达。

综上所述，SB-525334可抑制HSC I型胶原的分泌，并下调miR-29b、miR-19b的表达。SB-525334作为TGF-β1新的小分子抑制剂，其作用机制仍需进一步研究，在不同细胞，不同的药物浓度和作用时间，可能会影响药物作用的发挥，从而对不同基因的表达产生不同的影响。